解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1瞬转细胞株1.实验原理研究某个基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中过表达或者沉默该基因，建立细胞模型。根据所用方法和目的，可以分为稳转细胞株和瞬转细胞株。腺病毒或腺相关病毒（适用于体内），质粒，或RNA序列等，在转染试剂的作用下，可有效进入到细胞中，但基本不会整合到基因组里，作用也会随着细胞传代而逐渐丢失，因此被称为瞬时转染。瞬时转染具有操作简易，周期短，表达效率高，安全等优点，尽管作用时效有限，但也能满足一般科研周期需求，因此也是实验室里常用的基因编辑策略。2.实验目的建立瞬转细胞株模型3.实验材料3.1.主要试剂转染载体（腺病毒或腺相关病毒、质粒，或RNA序列等）、Opti-MEM培养基、转染试剂（常用磷酸钙或者商业化脂质体转染试剂，如Lipofectamine2000）、胰蛋白酶等解螺旋http://www.helixlife.cn/3.2.主要仪器生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机、显微镜解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn24.实验步骤4.1.腺病毒/腺相关病毒感染1.将处于对数期细胞用0.25%胰酶消化，1500rpm离心3min去上清，用培养基悬浮起来，制成细胞悬液。2.将血球技术板洗净擦干，吸取7.5μL细胞悬液，沿盖玻片一边缓慢加入细胞悬液，进行细胞计数。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.调整细胞密度，接种于6孔板中。待细胞贴壁后，轻轻吸去培养基，小心加入1ml含5μg/mlPolybrene的Opti-MEM培养基，再加入计算出的病毒量（病毒所需体积=细胞MOI*种板量/病毒滴度），轻轻混匀后放入细胞培养箱培养。4.培养8h后，吸去上清，加入新鲜培养基，继续放回培养箱中，培养24-48h。5.若慢病毒带有荧光，可在荧光显微镜下观察荧光效率，由此初步判断感染效率。也可收取部分细胞，qPCR或Westernblot检测一下基因标记的效率。4.2.质粒或RNA序列转染1.转染前24h，用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，进行细胞计数，用培养基调整细胞密度并接种于细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%～80%时用于转染。2.转染前2h将细胞培养基更换为基础培养基。3.无菌离心管中加入质粒和RNA，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，在室温下温育（比例和时间可根据转染试剂说明书）。4.Lipofectamine2000摇匀后取50μl在另一管中与0.95mlOpti-MEM混合稀释，在室温下温育5分钟（可根据转染试剂说明书）。5.稀释后的DNA与Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，控制在5分钟之内。6.室温...
