实验方法总结（4）：组织水平部分1、免疫组化....................................................................................................11.1SP法..........................................................................................................11.2双层夹心ELISA法.....................................................................................11.3胶体金法....................................................................................................22、HE染色......................................................................................................33、原位杂交....................................................................................................31、免疫组化1.1SP法单克隆抗体MMP-2、MMP-9,SP试剂盒购自ZYMED公司(1100)。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,微波加热抗原修复,10%正常羊血清孵育,滴加一抗,4℃冰箱中过夜,PBS缓冲液(Na2HPO48.1mmol/L,KH2PO41.5mmol/L,NaCl137mmol/L,2.7mmol/LpH7.4)振荡清洗后分别滴加二、三抗,DAB显色,苏木素复染,常规封片。1.2双层夹心ELISA法以纯化后的多克隆抗体作为捕获抗体，以本实验室已经制备的抗LMInternalinA单克隆抗体3R6为检测抗体，建立双抗夹心ELISA方法。具体步骤如下：多克隆抗体稀释液→洗板3次→3%BSA封闭→洗板3次→待测菌稀释液→洗板3次→单克隆抗体稀释液→洗板4次→酶标羊抗鼠IgG→洗板5次→TMB显色液→终止液→测定OD450值抗体、抗原和BSA稀释液均为0.01mol/L、pH7.4PBS。洗板液为含0.1%Tween-20的0.01mol/L、pH7.4PBS(PBST)。结果判定：以(测定孔OD值－空白对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值－空白对照孔OD值)≥2.1(即P/N≥2.1)时判断为阳性。1.3胶体金法①器皿洗涤准备,将锥形瓶等实验所用的玻璃器皿放入由重铬酸钾和浓硫酸配制的酸液中浸泡48h，取出后用蒸馏水反复冲洗，并用超纯水漂洗3~4次，烘干待用。②胶体金的制备胶体金熬制方法参照文献采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，具体方法步骤如下：在含有99mL超纯水的干净锥形瓶中加入1mL1%氯金酸溶液，配制成100mL0.01%氯金酸溶液；用恒温电磁力搅拌器不断搅拌加热沸腾；氯金酸溶液煮沸后快速加入1%柠檬酸三钠并不断搅拌，溶液颜色变成紫红色后，继续回流10min后停止加热，冷却至室温，存放4℃冰箱备用。③胶体金标记抗克伦特罗单克隆抗体胶体金...
