第52卷第4期第503页2023年8月华中科技大学学报(医学版)ActaMedUnivSciTechnolHuazhongVol.52No.4P.503Aug.2023*国家自然科学基金资助项目(No.82173475);江苏省“青蓝计划”资助项目(No.[2019]3)张兴海,男,1994年生,硕士研究生,E-mail:13776583744@163.com△通讯作者,Correspondingauthor,E-mail:gxsunny@xzhmu.edu.cnmiR-3133通过靶向HAS2促进人脐静脉内皮细胞自噬抑制血管生成对布加综合征的影响*张兴海,庄玉,姜敏,陈颜夙,孙桂香△徐州医科大学公共卫生学院,徐州221004摘要:目的探索miR-3133通过靶向透明质酸合成酶2(HAS2)促进细胞自噬,抑制血管生成,从而影响布加综合征中隔膜形成的作用,为布加综合征的病因研究提供新的线索,寻求潜在的治疗方法。方法利用透射电镜观察人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内自噬小体的数量,使用细胞自噬染色检测试剂盒,通过MDC法对细胞进行荧光染色,在荧光显微镜下观察自噬性死亡的细胞数量。通过Westernblot实验检测自噬标志蛋白p62和LC3的表达改变,从而验证miR-3133促进自噬的作用。通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力变化,管状形成实验检测细胞形成管道能力的变化,从而验证miR-3133通过促进自噬抑制血管生成。利用生物信息学软件miRanda进行预测,找到有可能成为miR-3133靶向调控对象的下游基因。转染miR-3133后使用Westernblot检测HAS2的蛋白表达改变,从而验证miR-3133能够靶向负调控HAS2。在使用小干扰RNA后,检测HUVECs的增殖能力和血管形成能力变化以及自噬标志蛋白表达的改变,从而验证miR-3133是通过靶向HAS2促进自噬抑制血管形成。结果透射电镜结果显示转染miR-3133mimic的细胞比其阴性对照具有更多的自噬体。在荧光显微镜下mimic组中出现更多的MDC染色;与对照组相比,在inhibi-tor组中观察到相对较少的MDC染色。CCK-8实验表明,miR-3133mimic减弱了HUVECs的增殖,而miR-3133inhibi-tor促进了HUVECs的增殖。与各对照组相比,miR-3133mimic组p62蛋白表达显著下调,而miR-3133inhibitor组表达增加,mimic组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,而inhibitor组降低。Westernblot结果显示,与各自的对照组相比,miR-3133mimic组中的HAS2表达受到抑制,而miR-3133inhibitor组中的表达上调。然而,miR-3133未能在mRNA水平上显著调节HAS2的表达。HUVECs敲除HAS2后,p62蛋白表达明显降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高。与阴性对照组相比,HAS2敲除组的HUVECs细胞增殖率和血管形成率显著降低。结论miR-3133可以通过靶向HAS2的表达,促进细胞自噬抑制血管生成,进而...
