病毒学报CHINESEJOURNALOFVIROLOGYVol.39No.2March2023第39卷第2期2023年3月利用CRISPR/Cas9系统构建ITGαV及ITGβ3敲除细胞系胡艺欣1#，吴兴一1#，李泽辉1，靳晓慧1，胡慧1，2*（1.河南农业大学动物医学院，郑州450002；2.河南省动物食品安全重点实验室，郑州450002）摘要：本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV（IntegrinαV，ITGαV）及整合素β3（Integrinβ3，ITGβ3）基因敲除的猪睾丸（Swinetesticle，ST）细胞系，进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒（Porcinedeltacorovirus，PDCoV）入侵过程中的作用及相互作用机制。根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA（sgRNA），并整合到LentiCRISPR‐V2载体上，与辅助质粒pSPA×2及pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装，包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用T7酶进行酶切检测，选出编辑效率较高的细胞群体，进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的ST‐ITGαVKO（敲除ITGαV基因的ST细胞）及ST‐ITGβ3KO（敲除ITGβ3基因的ST细胞）的单克隆细胞系进行测序和WesternBlotting鉴定，结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行PDCoV感染试验，结果表明敲除ITGαV、ITGβ3基因均可抑制PDCoV在ST细胞内的增殖，成功构建的ST‐ITGαVKO及ST‐ITGβ3KO细胞系为后续阐明ITGαV、ITGβ3在PDCoV入侵过程中的作用提供了细胞模型。关键词：整合素αV；整合素β3；CRISPR/Cas9；猪睾丸细胞；猪δ冠状病毒中图分类号：S828.9文献标识码：A文章编号：1000‐8721（2023）02‐0491‐08DOI：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.004292冠状病毒是目前已知最大的单股正链RNA病毒，具有广泛的宿主谱，可感染哺乳动物和鸟类，导致胃肠道、呼吸道和神经系统疾病。根据基因型的不同，冠状病毒可分为α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和δ冠状病毒属［1］。目前可导致猪肠道疾病的冠状病毒有α冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）、猪肠道甲型冠状病毒（Swineentericalphacoronavirus，SeACoV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swineacutediarrheasyndromecoronavirus，SADS‐CoV）以及δ冠状病毒属的猪δ冠状病毒（Porcinedeltacorovirus，PDCoV）。PDCoV作为δ冠状病毒属的新成员，具有较高致病性，临床上可引起猪呕吐、腹泻、脱...
