ICS65.020.30B40江苏省地方标准DB32DB32/T3686—2019山羊副流感病毒3型检测技术规程TechnicalregulationsfordetectionofCaprineparainfluenzavirus32019-12-04发布2019-12-25实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T3686—2019I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：李文良、毛立、李基棕、郝飞、刘茂军、杨蕾蕾、孙敏。DB32/T3686—20191山羊副流感病毒3型检测技术规程1范围本标准规定了山羊副流感病毒3型（Caprineparaifluenzavirus3,CPIV3）的病原学检测（病毒核酸的RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测）、血清学检测（血凝抑制（HI）试验）的技术要求。本标准适用于山羊副流感病毒3型及其感染情况的实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3病原学检测3.1材料微量移液器及吸头、DEPC水处理的离心管、吸头、PCR扩增管、TRIzol试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC处理水（用水符合GB/T6682规定）、反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液、2×一步法RT-PCR反应缓冲液、一步法荧光定量RT-PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、引物MF/MR、引物qMF/qMR与探针（附录A）。3.2仪器设备PCR仪、荧光定量PCR仪、台式冷冻离心机、电泳仪和水平电泳槽、凝胶成相仪（或紫外透射仪）。3.3反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）3.3.1样品处理与RNA的提取采集羊的鼻拭子、气管拭子或肺脏（样品的采集、保存和运输应符合NY/T541相关规定）。取200μL待检样品液至无菌无RNA酶的EP管中，使用TRIzol试剂、RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等方法提取RNA。3.3.2RT-PCR反应RT-PCR反应使用20μL体系：10μL2×一步法RT-PCR反应缓冲液、引物MF/MR各0.5μL（10μmol/L）、0.4μL反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液、4μLRNA模板，4.6μLDEPC处理水。反应条件为：45℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，进行35个循环；72℃延伸10min。3.3.3结果判定取PCR产物10μL，在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。样品PCR检测产物电泳后有大小为346bp的片段判断为山羊副流感病毒3型核酸阳性，无条带...
