ICS65.020.30B41DB13河北省地方标准DB13/T2609—2017禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法2017-11-22发布2017-12-22实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2609—2017I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李睿文、李丽敏、白云、韩庆安。DB13/T2609—20171禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法1范围本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与新城疫病毒。2缩略语下列缩略语适用于本文件。EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）3试剂或材料包括LSTRIzolRNA提取试剂或各种市售病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇，75%乙醇，1.0％琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100bp），2×TaqMasterMix。警示:氯仿属中等毒性，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗；电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。3.1LSTRIzolRNA提取试剂或病毒核酸提取试剂盒。3.2氯仿:又名三氯甲烷。3.31.0％琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。3.450×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。3.5溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。3.6焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。3.7DNA分子量标准（100bp）:包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分子量标准。3.8反转录酶:M-MLV反转录酶（200U/μL）或AMV反转录酶（10U/μL）。DB13/T2609—201723.9RNA酶抑制剂。3.102×TaqMasterMix:含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。3.11dNTP。浓度为2.5mM。3.12引物:反转录引物、上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物...
