ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T3208—2018羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofGoatContagiousEcthymaVirus文稿版次选择2018-10-20发布2018-11-20实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T3208—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽东方帝维生物制品股份有限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫生监督所、亳州市谯城区畜牧兽医局、旌德县畜牧兽医局、阜南县动物疫病预防与控制中心、肥东县动物疫病预防与控制中心、宿州市动物疫病预防与控制中心本标准主要起草人：王桂军、占松鹤、李雪松、祁克宗、朱良强、张星、张利亚、涂健、徐前明、方保根、冯育宁、陈静、郑举、方定平、兰梦蝶、刘雪梅、周迎春、王军、王楠楠、杨德康、车跃光。DB34/T3208—20181羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程1范围本标准规定了羊传染性脓疮病毒病料采集与处理、病毒分离及病毒鉴定技术要点。本标准适用于羊传染性脓疮病毒的分离与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3试验材料、试剂和仪器3.1材料增殖表皮癌细胞（HeLa）、羊睾丸原代细胞（Lambtestiscells，LT）、DMEM培养基、M199液体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、0.01mol/LpH7.0～7.4磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素、链霉素。3.2试剂DNA提取试剂盒、50×TAE缓冲液、琼脂糖。3.3仪器细胞培养箱、生物安全柜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像系统。4样品采集与处理4.1样品的采集按照NY/T541的规定执行，无菌采集疑似羊传染性脓疮病毒感染的病羊口唇、蹄部痂皮。4.2样品的保存样品应置于-80℃冷冻保存。4.3样品的处理先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌PBS与样品按体积质量比5﹕1匀浆，将样品匀浆冻存后再室温融解，反复三次。经5000r/min离心10min，取上清，并加入青霉素和链霉素，终浓度为2000IU/mL，0.22μm过滤除菌，置于-80℃待用。DB34/T3208—201825病毒分离5.1传代细胞培养使用DMEM培养液复苏HeLa细胞，取T25细胞培养瓶密度达到80％的单层HeLa细胞，弃去培养液，用灭菌PBS清洗三次，接种1...
