ICS11.220B41DB37山东省地方标准DB37/T4053—2020新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法Real-timePCRassayforthedetectionofgenotypeVIInewcastlediseasevirus2020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局发布DB37/T4053—2020I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学家禽研究所。本标准主要起草人：孟凯、吴家强、宋敏训、袁小远、张玉霞、杨金兴、艾武、王友令、亓丽红。DB37/T4053—20201新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法1范围本标准规定了新城疫病毒基因VII型（NDV）荧光定量PCR检测方法。本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及脑、肺脏、脾脏等组织中新城疫病毒基因VII型的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试验原理实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBRGreenI荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。4试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T6682规定的一级水。4.110×磷酸盐缓冲液PBS：pH值7.2。4.2研钵。4.3病毒RNA提取试剂盒。4.4SYBRGreenIRT-PCR缓冲液。4.5酶混合物：内含MLV反转录酶和RNaseInhibitor。4.6DNA聚合酶。4.7阳性对照：浓度为1.0×105拷贝/μL的阳性质粒。4.8阴性对照：水。4.9DEPC水。5仪器设备5.1微量可调移液器：最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL。5.2台式高速冷冻离心机：最高转速16000r/min。5.3荧光定量PCR仪：温度范围4.0℃～99.9℃。5.4分析天平：精度为0.01g。DB37/T4053—202025.5冰箱：规格为4℃和-20℃。5.6二级生物安全柜。6引物ForwardPrimer：5’-CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA-3’ReversePrimer：5’-GGATGTTGRCRGCATTCTKKT-3’注：Y=C或T；R=A或G；K=G或T7样品7.1采集工具棉拭子，剪刀，镊子，1.5mL离心管。7.2样品采集7.2.1咽喉拭子/泄殖腔拭子7.2.1.1咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮3次...
