2023年第45卷第2期ChinaPoultryVol.45，No.2.2023®遗传育种遗传育种miR-miR-302302d的载体构建的载体构建及其与及其与TleTle4基因的靶向关系验证基因的靶向关系验证吴宇慧1，席一凡1，张文慧1，程富富1，胡菜1，赵宗仪1，陈欣雨1，李熠2，张亚妮1*（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州225009；2.温州肯恩大学计算机科学与技术学院，浙江温州325035）摘要：试验旨在探究精原干细胞（SSCs）形成过程中的关键miR-302d行使功能的分子机制。试验克隆miR-302d前体序列并连入PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro构建miR-302d过表达载体（miR-302dmimics）；合成miR-302d的干扰靶点并连入PGMLV-SC5载体构建miR-302d干扰载体（miR-302dinhibitor）。通过生物信息预测获得miR-302d靶基因并构建其3′UTR的野生型（WT）和突变型载体（MT）；将miR-302d过表达载体分别与WT和MT载体共转染DF-1和293T细胞，检测靶基因3′UTR的活性。同时检测在DF-1细胞中过表达或干扰miR-302d后靶基因的表达变化。结果显示：成功构建miR-302d的过表达和干扰载体；预测结果显示Tle4为miR-302d的潜在靶基因，且该基因为ESCs分化为SSCs过程的重要基因；双荧光素酶活性检测结果显示不论是在DF-1还是293T细胞中，与转染WT+miR-NC组相比，转染WT+miR-302d组的双荧光素酶活性显著下降（P<0.05），而共转染MT+miR-302d组的荧光素酶活性差异不显著（P>0.05），且过表达miR-302d后下调Tle4的表达，而干扰miR-302d后上调Tle4的表达。结果表明，miR-302d可直接调节靶基因Tle4的表达。关键词：miR-302d；Tle4；双荧光素酶报告检测中图分类号：S831.2文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）02-20-07收稿日期：2021-10-20；修回日期：2022-02-14基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD1200305）；国家自然科学基金项目（32272857）作者简介：吴宇慧（1998-），女，硕士研究生，研究方向为动物胚胎工程与遗传工程，E-mail：1615743280@qq.com*通讯作者：张亚妮（1977-），女，博士，教授，主要从事家禽遗传育种研究，E-mail：ynzhang@yzu.edu.cndoi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.004VectorConstructionofmiR-302dandTargetingVerificationBetweenmiR-302dandTle4GeneWUYuhui1,XIYifan1,ZHANGWenhui1,CHENGFufu1,HUCai1,ZHAOZongyi1,CHENXinyu1,LIYi2,ZHANGYani1*（1.JiangsuKeyLaboratoryofAnimalGeneticsBreedingandMolecularDesign,C...
