贴壁细胞培养、传代及活性测定等.pdf

7978概述从培养容器中去除培养基，PBS漂洗一下，将胰蛋白酶加入细胞，孵育，加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的反应，分散细胞，稀释后放回培养箱。1.吸去用过的培养基并丢弃之。2.向培养瓶中加入PBS（10 mL/75 cm2 瓶面积），注意不要扰动单细胞层。轻轻前后摇动培养瓶以漂洗单细胞层。然后去除PBS。3.加入胰蛋白酶(3mL/75cm2瓶面积)，然后摇动培养瓶以保证整个单细胞层都被胰蛋白酶溶液覆盖。4.孵育至细胞开始脱壁，通常3-5分钟。需要注意不要使细胞暴露在胰蛋白酶溶液的时间过长。还要注意不要在细胞消化不充分的情况下强行使之脱壁，这样容易使细胞聚集成团。5.加入含有血清的培养基（310mL/75cm2瓶面积），上下吹打细胞，直到细胞分散成单细胞悬液。6.用血球计数板或库尔特粒度仪计数并将细胞稀释到合适的接种浓度。7.向含有培养基的新的细胞培养瓶中加入适当体积的细胞悬液。8.将培养瓶放入培养箱，拧松瓶盖1/4圈，以便气体交换。讨论血清中含有胰蛋白酶的抑制剂。因此在第2步处理的时候，去除痕量的血清非常重要。第5步中培养基中含有的血清会使残留的胰蛋白酶失活并保护细胞免受伤害。如果使用无血清培养基，则可能需要另外添加胰蛋白酶的抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶的孵育时间和分散细胞成为单细胞悬液使用的力度根据不同的细胞株也有所不同。有必要调整这些参数来适应您所培养的细胞。贴壁细胞系的传代改编自Freshney,R.I.,1994。动物细胞培养：基本技术手册。第3版，Wiley-Liss，纽约，美国。未命名-2 22013/3/5 17:35:177978概述从培养容器中去除培养基，PBS漂洗一下，将胰蛋白酶加入细胞，孵育，加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的反应，分散细胞，稀释后放回培养箱。1.吸去用过的培养基并丢弃之。2.向培养瓶中加入PBS（10 mL/75 cm2 瓶面积），注意不要扰动单细胞层。轻轻前后摇动培养瓶以漂洗单细胞层。然后去除PBS。3.加入胰蛋白酶(3mL/75cm2瓶面积)，然后摇动培养瓶以保证整个单细胞层都被胰蛋白酶溶液覆盖。4.孵育至细胞开始脱壁，通常3-5分钟。需要注意不要使细胞暴露在胰蛋白酶溶液的时间过长。还要注意不要在细胞消化不充分的情况下强行使之脱壁，这样容易使细胞聚集成团。5.加入含有血清的培养基（310mL/75cm2瓶面积），上下吹打细胞，直到细胞分散成单细胞悬液。6.用血球计数板或库尔特粒度仪计数并将细胞稀释到合适的接种浓度。7.向含有培养基的新的细胞培养瓶中加入适当体积的细胞悬液。8.将培养瓶放入培养箱，拧松瓶盖1/4圈，以便气体交换。讨论血清中含有胰蛋白酶的抑制剂。因此在第2步处理的时候，去除痕量的血清非常重要。第5步中培养基中含有的血清会使残留的胰蛋白酶失活并保护细胞免受伤害。如果使用无血清培养基，则可能需要另外添加胰蛋白酶的抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶的孵育时间和分散细胞成为单细胞悬液使用的力度根据不同的细胞株也有所不同。有必要调整这些参数来适应您所培养的细胞。贴壁细胞系的传代改编自Freshney,R.I.,1994。动物细胞培养：基本技术手册。第3版，Wiley-Liss，纽约，美国。细胞活力分析可以测定细胞悬液中存活细胞的百分比。一般通过染料排除的染色方法实现，即具有完整细胞膜的细胞能够将染料排除在外从而不被染色，而不具备完整细胞膜的细胞则能够吸收染料而被染色。用于排除染色法的染料通常选择台盼蓝，但是赤藓红和萘黑也常被使用。吸收染料的染色方法也可以用于测定细胞活力。这种情况下，染料被活细胞正常吸收，而死细胞则不会。例如双乙酰荧光素就是这类染色方法中所使用的染料。台盼蓝染色的方法应用较为广泛，操作方法如下所述：1.制备用于分析的细胞悬液（大约106 个细胞/毫升）。2.制备用0.4%台盼蓝溶液(SV30084.01)1：1稀释的细胞悬液。3.将稀释液加入血球计数板的计数池中（见血球计数板）。4.静置1-2分钟（时间不要太长，否则活细胞也会死亡并开始吸收染料）。5.用血球计数板计算被染色的细胞数和总细胞数。6.未被染色的细胞百分比则代表了活细胞的百分比。细胞活力分析改编自Freshney,R.I.,1994。动物细胞培养：基本技术手册，第3版，Wiley-Liss，纽约，美国。未命名-2 32013/3/5 17:35:178180步骤1.显微镜检测细胞以保证细胞生长汇合度为60-90%，细胞形态正常，无微生物污染。2.融化细胞脱壁用溶液（胰蛋白酶SH30236.01或HyQTase SV30030.01）以供使用。3.无菌操作下，从细胞培养器中倒出培养基，用无菌的PBS漂洗单细胞层两遍，最后一次漂洗后尽量去除残留液体。4.使用无菌的吸管，按照无菌操作要 求 向 培 养 器 中 加 入 脱 壁 溶 液（510 mL/75 cm2表面积）。轻轻摇动封闭的培养器使溶液完全浸润单细胞层。5.每2-3分钟检查一次细胞脱壁情况。根据不同细胞系，完全脱壁所需的时间大约为5-15分钟。有些细胞系可能需要离心，并/或在37孵育5-10分钟。HyQTase 和胰酶消化操作方法用于传代和扩增的细胞脱壁步骤a.如果使用HyQTase，则不需要中和的步骤。一旦所有的细胞都脱壁了，无菌去除HyQTase溶液，然后简单地进行细胞计数和传代操作即可。b.如果使用胰蛋白酶，无菌地从培养器中去除胰蛋白酶溶液。然后加入与所使用的胰蛋白酶溶液大致等体积的、含有血清的完全培养基或大豆胰蛋白酶抑制剂溶液。上下吹吸培养基或大豆胰蛋白酶抑制剂溶液几次，以充分吹散细胞，然后冲洗细胞培养器。如果使用大豆胰蛋白酶抑制剂，则需将细胞在离心管中以100g离心大约5分钟。一旦离心结束，用各自的完全培养基重悬细胞。在这一步，得到完全分散的单细胞悬液非常重要。6.中和：7.对细胞进行计数和传代操作。未命名-2 42013/3/5 17:35:178180步骤1.显微镜检测细胞以保证细胞生长汇合度为60-90%，细胞形态正常，无微生物污染。2.融化细胞脱壁用溶液（胰蛋白酶SH30236.01或HyQTase SV30030.01）以供使用。3.无菌操作下，从细胞培养器中倒出培养基，用无菌的PBS漂洗单细胞层两遍，最后一次漂洗后尽量去除残留液体。4.使用无菌的吸管，按照无菌操作要 求 向 培 养 器 中 加 入 脱 壁 溶 液（510 mL/75 cm2表面积）。轻轻摇动封闭的培养器使溶液完全浸润单细胞层。5.每2-3分钟检查一次细胞脱壁情况。根据不同细胞系，完全脱壁所需的时间大约为5-15分钟。有些细胞系可能需要离心，并/或在37孵育5-10分钟。血球计数板广泛用于测定细胞悬液的细胞浓度。材料：1.细胞悬液2.血球计数板及盖玻片3.计数器4.巴斯德吸管5.显微镜 步骤：1.将盖玻片盖在血球计数板的计数室上方，使用巴斯德吸管，在V形计数室的边缘加入一滴细胞悬液。使悬液通过毛细作用流入计数室。注意所加液体不要溢出或未充满计数室。用同样的方式填满另外一边的计数室。2.将计数室放在显微镜载物台上。3.血球计数板含有9个1mm2的正方形区域，每个区域又分成更小的区域。每一个1mm2的区域代表0.1mm3或10-4mL的体积。使用10倍物镜，计算1mm2区域的细胞数。如果1mm2面积不足100个细胞，则应该数两个或更多1 mm2区域取平均值。4.应用同样的方法计算血球计数板另一侧的细胞数。5.首先计算所有数过的1mm2区域的细胞数平均值，然后应用如下公式计算细胞密度：c=n/vc细胞浓度（细胞数/mL）n所有1mm2区域的细胞数平均 值（细胞数/mm2）v所计算的体积，在这里为10-4 因此，c=n 10-4。用血球计数板进行细胞计数改编自Mather,J.P.,&P.E.Roberts，1998。细胞与组织培养介绍：理论和技术，Plenum出版社，纽约&伦敦。细胞培养方法介绍a.如果使用HyQTase，则不需要中和的步骤。一旦所有的细胞都脱壁了，无菌去除HyQTase溶液，然后简单地进行细胞计数和传代操作即可。b.如果使用胰蛋白酶，无菌地从培养器中去除胰蛋白酶溶液。然后加入与所使用的胰蛋白酶溶液大致等体积的、含有血清的完全培养基或大豆胰蛋白酶抑制剂溶液。上下吹吸培养基或大豆胰蛋白酶抑制剂溶液几次，以充分吹散细胞，然后冲洗细胞培养器。如果使用大豆胰蛋白酶抑制剂，则需将细胞在离心管中以100g离心大约5分钟。一旦离心结束，用各自的完全培养基重悬细胞。在这一步，得到完全分散的单细胞悬液非常重要。6.中和：7.对细胞进行计数和传代操作。未命名-2 52013/3/5 17:35:178382生长曲线在评估细胞系的生长特性时非常有用。从生长曲线上，我们可以得到延迟时间、倍增时间和饱和密度等。材料：1.细胞2.组织培养皿或瓶3.生长培养基4.胰蛋白酶 步骤：1.胰酶消化细胞并离心。2.用5毫升培养基重悬细胞并计数（见血球计数板计数）。3.用适当体积的培养基稀释细胞悬液得到合适浓度的细胞悬液用于接种，接种细胞密度为每平方厘米表面积2 103个细胞。不同细胞系的接种密度不同。4.混合均匀，将适量体积稀释后的细胞悬液接种于培养皿/瓶内。5.计算出剩余细胞悬液中的细胞密度，以确定实际接种的细胞密度。6.将培养皿放入培养箱。7.对传代的培养皿每24小时进行一次细胞计数。8.将结果用对数-线性曲线进行作图。倍增生长时间的确定首先是通过确定曲线指数期开始时的细胞数目，然后跟踪曲线，找到细胞数目翻倍的时间点，最后计算两者之间的时间。生长曲线的绘制改编自Mather,J.P.,&P.E.Roberts，1998。细胞与组织培养介绍：理论和技术，Plenum出版社，纽约&伦敦。未命名-2 62013/3/5 17:35:178382生长曲线在评估细胞系的生长特性时非常有用。从生长曲线上，我们可以得到延迟时间、倍增时间和饱和密度等。材料：1.细胞2.组织培养皿或瓶3.生长培养基4.胰蛋白酶 步骤：1.胰酶消化细胞并离心。2.用5毫升培养基重悬细胞并计数（见血球计数板计数）。3.用适当体积的培养基稀释细胞悬液得到合适浓度的细胞悬液用于接种，接种细胞密度为每平方厘米表面积2 103个细胞。不同细胞系的接种密度不同。4.混合均匀，将适量体积稀释后的细胞悬液接种于培养皿/瓶内。5.计算出剩余细胞悬液中的细胞密度，以确定实际接种的细胞密度。6.将培养皿放入培养箱。7.对传代的培养皿每24小时进行一次细胞计数。8.将结果用对数-线性曲线进行作图。倍增生长时间的确定首先是通过确定曲线指数期开始时的细胞数目，然后跟踪曲线，找到细胞数目翻倍的时间点，最后计算两者之间的时间。接种效率是通过测量由单细胞形成的集落数目确定的。这是一个非常灵敏的检测，经常被用于测定细胞的营养需求，检测血清含量，测定生长因子的效应以及毒性测试。材料：1.细胞2.细胞培养板或培养瓶3.离心管4.生长培养基5.胰蛋白酶6.10%福尔马林7.0.1%结晶紫 步骤：1.用胰酶消化细胞（见贴壁细胞系传代，第78页）后离心。2.用5-10毫升生长培养基重悬细胞并计算细胞悬液的浓度（见血球计数板计数）3.计算并配制浓度分别为2、10和20个细胞/平方厘米表面积的细胞悬液。4.将适当体积的细胞悬液平行接种在细胞培养板/培养瓶中。在接种前要混合细胞悬液以保证悬液均匀。5.将细胞孵育大约10天。根据细胞系不同和培养条件的不同，这个时间也有所变化。要求形成的细胞集落肉眼可见，但不应该连在一起。6.用PBS洗培养板/培养瓶，用10%福尔马林浸没细胞，固定10分钟。7.去除福尔马林，加入结晶紫浸没细胞然后静置10分钟。8.用水漂洗到没有额外的颜色从培养板/培养瓶上洗下来。9.数出集落数，然后计算接种效率。接种效率=形成的集落数/接种的细胞数100。接种效率的测定改编自Mather,J.P.,&P.E.Roberts，1998。细胞与组织培养介绍：理论和技术，Plenum出版社，纽约&伦敦。未命名-2 72013/3/5 1