第一篇：分子生物学实验步骤总结超全（共）

一 目的基因的获得 细菌基因组DNA的提取

（一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头

（二）试剂

1）溶液1: 25% 蔗糖

50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L

EDTA，pH8.0 500ug/ml

溶菌酶（现用现配）

100ug/ml

RNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/L

Tris-Hcl，pH8.0

1%

SDS

400ug/ml

蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4）氯仿：异戊醇（24：1）5）3mol/L NaAc(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇

8)TE缓冲液： 10mmol/L

Tris-Hcl，pH8.0

1mmol/L

EDTA，pH8.0(三)实验步骤

1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。

4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。

5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。

6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。

7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。

8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

植物DNA的SDS提取法：

（一）试验试剂：

1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH 调至pH7.0，并定容至1000ml。

2）10 SSC溶液：称取87.66gNaCl 和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。

5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl 溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6）氯仿－异戊醇：按24ml 氯仿和1ml 异戊醇混合。

7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8)SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9)1mol／LHCl。10)0.2mol/LNaOH。

11)二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml 冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml 乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12)1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13)0.05mol/LNaOH。

14)DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml 至50ml 容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml 的标准溶液。

（二）实验步骤： 1)称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml 预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2)将匀浆无损转入25ml 刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3)离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4)将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5)再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6)用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7)然后加入0.5ml 左右的10 SSC，使最终浓度为1 SSC。8)重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9)加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10)加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11)再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

二、PCR扩增目的基因

(一)器材 1)微量移液器

2)灭菌的Tip头、PCR管 3)PCR扩增仪

4)目的DNA（DNA模板）5)dNTP混合物 6)引物对 7)Tap酶

8)PCR扩增试剂盒

（二）试剂

1）10×PCR 缓冲液（含Tris-HCl 100mmol/L;MgCl2 15mmol/L、KCl 500mmol/L, pH8.3，0.1%明胶）

2)脱氧核苷三磷酸dNTPs：配成 10mM—— dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。）

3）氯仿-异戊醇：配成24：1的比例，室温避光保存。4)酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 5)3M NaAc、ddH2O 6)无水乙醇：70%乙醇 7)TE缓冲液

（三）实验步骤

1）在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份：（混匀）

ddH2O: 补至终体积（25μl）10×PCR缓冲液 1/10总体积 2.0mM dNTPs 1μl

2U/μl Taq DNA聚合酶 0.5μl

引物混合液（10 pmol /μl /引物）1μl

DNA模板 0.6μl

混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。2）在设定好的PCR仪上反应 95°C，5min；95°C，1min；56°C，1min；72°C，2min。反应30轮。

3）反应结束后，将反应管在72°C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至4°C。取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三)，确认是否有目的的PCR产物。如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善。纯化继续4）—6）。4）转至1.5ml离心管，向管中加25μl酚，25μl氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。5）吸取上层液，转至另一已加5μl 3M NaAc的1.5ml的离心管，加150μl无水乙醇，-20°C过夜。

6）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加0.5ml 70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。弃上清，烤箱中干（60°C），溶于20μl TE。

（四）技术要点

1）PCR各组份的配制与加样量要特别注意。

(1)引物浓度：10 pmol 足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非 特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。

(2)引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1 OD约含33μg。开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2μg/μl，再取部分稀释至10 pmol /μl。引物浓度计算公式：1pmol=(3.3×10μg)×n，n是引物的碱基数

(3)Mg：使用浓度一般在1.5mM，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团，Mg浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。

(4)模板DNA：浓度不可过高，质粒DNA 20ng即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。

(5)Taq DNA聚合酶：一般用量5U/100μl。酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3’端加A。2）扩增轮数与退火温度

扩增轮数：一般30轮以内就可使模板扩增10倍，超过30轮，错配率升高。退火温度计算公式：Tm值=（GC×4+AT×2）–4

6-42+2+

三、琼脂糖凝胶电泳的检测

(一)仪器

1）琼脂糖凝胶电泳系统（天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪）2）凝胶成像仪(二)试剂及材料

目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂

盒

1)TAE电泳缓冲液

浓储存液 50×：242g Tris；57.1ml冰乙酸；100ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)

定容至一升。

使用液 1×：4.84g Tris；1.15ml冰乙酸；2ml 0.5 mol/L EDTA(PH8.0)定容至一升。2）样本液

10×缓冲液: 60%蔗糖；0.4%溴酚蓝

（三）实验步骤

1）将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。

2）0.8%琼脂凝胶板的配制：取0.6g琼脂糖加80ml TAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55°C-65°C，加入EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。

3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。

4）DNA样品按照10：1的比例加入样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。5）接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停止电泳。6）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。（四）技术要点

1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。表1 不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度（%）

0.3 0.6 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 2）电泳中注意防止凝胶发热。

3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。随着电压的增加，琼脂

糖凝胶的有效分离范围缩小。

4）溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。

60～5 20～1 10～0.8 7～0.5 6～0.4 3～0.2 2～0.1

分离DNA的有效范围（kb）

四、目的DNA的回收纯化

(一)仪器

1）琼脂糖凝胶电泳系统 2）凝胶成像仪 3）离心机 4）单面刀片 5）恒温水浴锅(二）试剂

1）DNA回收试剂盒 2）50×TAE 3）ddH2O(三)实验步骤

1）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。2）按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。

4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6）12000rpm 室温空离心1分钟。

7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。

五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组

(一)仪器及材料 1）回收得到的目的DNA

2）BamHI、HindIII、T4 DNA连接酶、DNA回收试剂盒 3）pUC18‐CAT 质粒、双蒸水、10×酶切通用缓冲液K 4）EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机

表1 常用酶切缓冲液配方

缓冲液名称

配 方

10×L

100mM

Tris-HCl,pH7.5 100mM MgCl

210 mM DTT 10×M

100mM

Tris-HCl,pH7.5 100mM MgCl2mM DTT 500mM NaCl 10×H

500mM

Tris-HCl,pH7.5 100mM MgCl2mM DTT 1000mM NaCl 10×K

200 mM Tris-HCl,pH8.5 100 mM MgCl2mM DTT 1000mM KCl 10×T（BSA－Free）

330mM

Tris-Ac,pH7.9 100mM MgAc 5 mM DTT 660mM KAc

0.1% BSA 0.1% Trition X-100

贮存温度（℃）-20

-20-20

(二）实验步骤

1）在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系： 酶切反应体系（20ul体系）

管号 核酸 10×酶切通用缓冲液K ddH2O BamHI

HindIII 1 15ul目的DNA

2ul

0ul

2ul

1ul 2

10ulpUC18‐CAT质粒 2ul 5ul 2ul 1ul 2)37℃保温三小时。

3)酶切产物的纯化回收，每100ul溶液加入700ul溶胶液，其余的操作步骤详见实验四 4)载体与目的DNA的连接。在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系（20ul）： 目的DNA pUC18‐CAT质粒 10×连接缓冲液 T4 DNA连接酶

ddH2O

X ul

Y ul

2ul

1ul

Zul 目的DNA和pUC18‐CAT质粒的相对浓度约为1:3—1:10 5）14℃水浴保温过夜。

六、大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化

(一)仪器

1．小型高速离心机 2．恒温摇床 3．恒温培养箱 4．‐20℃冰箱 5．恒温水浴器 6．超净工作台 7．高压灭菌锅(二)材料 1．氨苄青霉素 2．大肠杆菌DH5a 3．连接产物 4．离心管

5．枪头、微量移液器 6．试管、培养皿、三角瓶(三)试剂

LB 培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/L 胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。氨苄青霉素：

用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。卡那霉素：

用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存 无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。

含有抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；当培养基降温至50℃左右，加入终浓度为100μg/ml 的氨苄青霉素或50μg/ml卡那霉素，并铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。0.1 M CaCl2（根据需要确定配制的量）：

11.099克溶解在1000ml灭菌水中，0.22μm滤器过滤除菌。氯化钙分子量为：110.99。50％甘油：

50ml甘油加入50ml水，混匀，高压灭菌。其他：

DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加250ml LB液体培养基的1000ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml和500 mL离心管若干，灭菌刻度吸管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。

（四）实验步骤

1）以接菌环从－70℃保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时； 2）挑取单菌落接种于5 mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

3）按照1:100接种菌液至250 mL LB培养基中，37℃剧烈振荡培养1.5-2 小时左右，至OD600达0.4-0.6；

4）将菌液冰浴10 分钟，转移至预冷的500 mL离心管中，4℃，4000 rpm离心10 分钟； 5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于50 mL预冷的0.1 M CaCl2中，冰浴20 分钟，4℃，4000 rpm离心10 分钟；

6）弃尽上清。以12.5 mL（菌液体积的5％）预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支50μL在冰上分装，－80℃保存； 注：以上操作全部在无菌条件下进行。

7）取连接产物2μl（在实际操作中，经常需要取全部连接产物）置于冰上； 8）从－80℃冰箱取3管感受态细菌（每管50μl），在冰上融化；

9）将连接产物加入感受态细菌中，混匀，放置冰上20－30分钟；同时做两个对照管

• 受体菌对照：50μl感受态细胞+2μl无菌水 • 质粒对照：50μl0.1 M CaCl2溶液+2μl连接产物 10）42℃加热90秒，迅速置于冰上1－2分钟；

11）每管加入400－1000μl的无抗生素液体LB培养基，在37℃摇床缓慢摇荡20－60分钟； 12）用<10000rpm离心10秒，弃去大部分上清，留下约50μl并用移液器吹吸重悬细菌； 13）取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定）的LB琼脂糖平板上，倒置于37℃培养箱培养12小时以上，出现菌落。

（五）技术要点

1．加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5％； 2．42℃热激时，必须要保证温度的准确性；

3．涂布LB平板的菌液量应该根据经验确定。如果连接效率很高，而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在LB平板上生长密度合适的单菌落；

4．涂布平板之后，在37℃培养的时间不超过12－16小时，否则可能产生卫星菌落； 5．防止其它质粒污染； 6．防止其它细菌污染。

七、质粒DNA的提取及重组子的鉴定

(一)仪器 1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．小型高速离心机 4．高压灭菌锅 5．分光光度计

（二）试剂及材料 1.转化重组子

2.缓冲液A：50mM葡萄糖；10mM EDTA；25mM Tris-HCl，pH8.0。3.碱溶液：0.2M NaOH;1%SDS, PH12.5。

4.乙酸缓冲液：3M NaAC；2M乙酸，pH4.8（盐酸调pH）。5.TE缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA.。

6.RNA酶A溶液：10mg/ml RNA酶 A，用TE配制，100°C煮10分钟，灭活DNA酶。缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min,上清于-20°C保存。

7.LB培养基: 10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl加水至1000ml，用1M NaOH调pH至7.5，高压灭菌。

8.氨苄青霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。9.LA培养基: 在LB培养基中加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。10.异丙醇

11.酚-氯仿-异戊醇：25：24：1 12.70%乙醇 13.3M NaAc

（三）实验步骤

1）从转化平皿上挑一克隆接种到LA液体培养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1—1.2时，收获细菌。菌液转到1.5mlEppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。

2）加100μl缓冲液A，充分混悬细菌。

3）加200μl碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。4）加150μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。5）离心10000rpm，5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。

6）加等体积的酚-l氯仿-异戊醇（25：24：1）混匀，离心10000rpm，1分钟。7）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加等体积的氯仿混匀，离心10000rpm，1分钟。8）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温或-20°C，10分钟。

9）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加入1ml 70%乙醇。勿混匀，离心10000rpm，5分钟，重复加入1ml 70%乙醇一次，弃上清，干燥箱中干燥。

10）干燥后，加入30μl TE（含RNA酶A 10ul，20μg/ml），使质粒溶解，-20°C保存备用。11)取一个灭菌的EP管，依次加入下列试剂

10×限制酶缓冲液2.0ul、重组质粒5.0ul、ddH2O 11.0ul、限制性内切酶2.0ul总体积为20.0ul。

12）将上述试剂轻轻混匀，稍加离心，集中溶液，37°C水浴保温3—4小时。酶切结束时，加入0.5mmol/L EDTA(PH8.0)使终浓度达10mmol/L，以终止反应。13）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。

（四）技术要点

1）每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA，第一步需使菌体完全重悬。

2）加入碱溶液后，反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮）必须马上加乙酸缓冲液中和。

3）70%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。

第二篇：超英分子生物学实验

超英生物实验室分子生物学系列服务项目

1、DNA提取（组织、细胞、血液、蜡块）,质粒提取，基因克隆、纯化。

2、蛋白提取、定量。原核及真核基因蛋白表达纯化（盐析与透析）、分析鉴定、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,western-blot(常规DAB显色及化学发光)

蛋白组学相关技术

免疫蛋白质印迹(Western blotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

3、总RNA提取 定量、电泳。总RNA是一种非常重要的试验材料。本公司可以提供从多种材料中提取总RNA的服务。常见的有：血液、培养细胞、动物组织、植物

4、聚合酶链反应（PCR）

5、RT-PCR：组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA.再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达.降落PCR 引物设计及PCR相关实验

6、细胞培养、细胞冻存、原代细胞的分离与培养、细胞转染及细胞生物学相关技术

7、细胞凋亡检测(TUNEL,单细胞凝胶电泳等)

8、细胞周期调控,同步化细胞

9、特殊的细胞爬片材料,提供检测爬片细胞的特异性抗体检测,客户所感兴趣的基因检测

(RISH,DISH,IS-PCR,PRINS)

第三篇：分子生物学实验总结

分子生物学实验

1.TOMY全自动灭菌锅的使用

（1）检查排放蒸汽的水壶，腔体内的水位与托板齐平。（2）SET键设置温度和时间（121℃，20min）（3）关闭排气阀，Start机器开始运行，Check Heat检查设置的温度，Stop键终止机器运行。（4）程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降至80℃以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子。（5）腔体内经常清洁。2.LB液体培养基（1000mL）

将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1000mL，121℃湿热灭菌20min。冷却后4℃保存备用。固体还要再加琼脂。3.碱裂解法

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此缠绕，仍会紧密的结合在一起。当加入 pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液，恢复pH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用。溶液Ⅱ：氢氧化钠，SDS 氢氧化钠加入后碱性环境12-12.5促使染色体DNA与质粒的变性解离成单链。SDS是一种阴离子去垢剂，它的主要作用有：①溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；②解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质与DNA分开；③SDS能与蛋白质结合成为SDS-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止对DNA的降解。

溶液Ⅲ：乙酸钾。用pH4.2的KAc溶液是为了调整溶液pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L醋酸钾(KAc)有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。4.loading buffer 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。5.限制性内切酶（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

(II型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。6.引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则： 引物长度约为16～30bp；引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度；四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误；引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对；在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构；两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量；引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点；引物不与模板结合位点以外的序列互补；简并引物应选用简并程度低的密码子；引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量。7.dNTP 常用的浓度为20～200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入；dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度；注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。8.感受态

处于对数生长期的细菌经低温CaCl2处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源 DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。9.转化

转化是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。10.DNA连接酶

有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶；DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过牛小肠碱性磷酸酶CIP处理克服； 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定；

pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专用载体，该载体由pUC18 载体改建并在其3’端添加“T”而成

大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率；

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 11.α互补

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法； α互补：质粒载体上lacZ’基因编码的α肽段与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现互补的现象，由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal显色测定出来；任何携带着lacZ’基因的质粒载体在转化β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

第四篇：分子生物学实验 心得体会

关于分子生物学实验的体会

梁慧媛（生技01级）

不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。

首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。

失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。

一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的“试炼”。

分子生物学实验心得体会

刘东强（生科01级）

分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。

随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA的制备、PCR技术等。

我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。

此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。

总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值。

刘佳凝（生技01级）

一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会：

1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我们在学习操作。

2、实验老师的耐心指导对我们帮助很大。他们要求严格，待人和蔼可亲，实验要求严且对实验技术的知识的深刻掌握与理解给我们留下了很深刻的印象。在老师们的带领下我们都很认真完成了每一次的实验与之后的总结与报告。

3、由于分子生物学实验是我们上大学后接触的第一个大型实验课，所以这对我们来说是一个磨练的过程。从不熟练当熟练，从不耐烦到耐心认真，每个人在一学期后都有一种“脱胎换骨”的感觉。同时这个实验帮助我们从分认识到生物学的不可知性、变化多样性及创新空间的广博性。在学期后的设计实验中，每组同学都努力开动脑筋，搜集资料，查阅文献，提出了很多好的实验方案。这种设计与创新调动了同学的同学们的积极性，使得大家在实验过程中都更加认真、仔细、一丝不苟，并在获得到好的实验结果后体会到了前所未有的成就感。

所以我们都很感谢分子生物学实验的老师及设计这门课的老师们。这个实验让我们受益非浅。

实验心得体会

张鑫蕊（生科01级）

通过分子生物学实验课的学习，我们首先了解了分子生物学常用的载体，即质粒载体的制备及宿主细胞的感受态的制备。这些都让我们在学过书本状的知识以后有了一个亲手操作，更深一步所学的知识的机会。

生物学以及分子生物学本身就是一门实验性的学科，如果只有单纯的理论课上的讲解而没有与之相配套的实验操作，跟的无法使我们深刻体会到我们所学的那些如转导转化之类究竟是怎样操纵的。

至于PCR基因扩增、RT-PCR、蛋白质印迹这些实验操作技术的学习对我们以后生物化学大实验、生化技术原理、基因工程、蛋白质工程的学习都奠定了一个很坚实的基础，帮助我们对这一系列等分子生物学技术有了很好的了解和掌握的。

相配套的理论课的学习与实验操作上是非常必要，我觉得分子实验课的时间安排就相当合理，在我们学理论课的同时就进行实验课的操作，这样相辅相承的学习，才能促进我们的进一步提高。

实验心得

刘娟（生科01级）

一、实验操作：

同样的样品，同样的步骤，不同的人可以作出不同的结果。

当然分子生物学实验本身的结果就有一定的偶然性，因为所操作的材料是极其微小的，肉眼无法看见的，所以用理论来预见可行的实验，结果往往有些出乎意料。而每个人操作上的细微差别对RNA、DNA而言就是一场地震。

有人说做生物实验和学数学不一样，数学只要用灵活的思维，严禁的逻辑就行，而生物实验要求的往往不止这些，不只要心灵还要手巧肯干，而分子实验又比其他实验要求严格，每一步都须三思而后行，而且必须有极大的耐心去重复一些枯燥的步骤。

二、关于设计实验：

想总比做起来容易，当初觉得mRNA差异显示原理简单，操作应该不成问题。结果第一天的实验便给了个下马威，不仅结果等于没有，而且对接下来的步骤更是一无所知，无从下手。而最终自己的实验结果只不过是mRNA差异显示地预实验，由于该方法的假阳性率极高，正常的科研实验是需要反复重复实验，并将最后的结果测序分析，并进一步分析是否为新基因，当然我们不可能接着做，只完成了该实验的一小步，也已经学到了很多书上没有的东西。

三、还存在的问题：

自己在做的过程中，有时会有“照方抓药”的情况出现，并不完全明白自己所做的步骤有什么作用便做了，事前事后缺乏思考。实验过程中，仪器、试剂的收集，总只有几个人在做，其他人只是张口就问在哪，说明摆放无秩序，做实验时依赖心理太强，（看完其他国外的几个实验室照片后，觉得我们实验室已经不错了。）

每一步骤最好都有记录，特别是样品多时，要有据可查。

一门好实验课

中国协和医科大学基础医学院 2003级研究生 陆璐

我是生物科学专业99级的学生，在大三的时候选修了分子生物学实验这门课。在半年的学习和实践中，我学会了很多基础的分子生物学实验方法，掌握了一定的实验技能，这些都为现阶段的实验工作提供了很大的帮助，这使我避免了刚刚进入实验室工作时要一切从头学起的忙乱，节省了大量时间。

分子生物学实验课上所讲授的质粒提取、蓝白斑筛选、RNA提取及鉴定、基因组DNA提取、western blot、琼脂糖凝胶电泳、PCR技术等都是我现在常用的技术。在实验课的训练中，我也逐步养成了良好的实验习惯。

分子生物学实验课程让我受益很多，老师们认真负责的态度也必然让更多的师弟师妹们从中获益。

我是北京师范大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业2002级的硕士研究生，在研一第一学期参加了分子生物学实验课程。这门课程将分子生物学实验操作的理论与实践相结合，不仅使我在分子生物学实验技能方面得到系统的训练，而且让我对具体实验操作的原理有了清晰地认识。尤为难得的是，作为一门实验课，它还锻炼了我运用已学到的理论知识和已掌握的实验技能综合解决科学问题的能力。这些都为我之后研究生阶段的工作做了必要的准备，打下了良好的基础。

这门课程开设的实验以综合性为主，涵盖面广，几乎包括一般分子生物学研究会涉及的所有内容：最基本实验技术，如琼脂糖凝胶电泳检测DNA；基因克隆所要用到的技术，如质粒提取、DNA重组及重组子筛选、细菌感受态的制备及转化、外源基因的诱导表达等；还有一些其他的常用技术，如动、植物基因组DNA的提取、植物总RNA的提取、PCR扩增、蛋白质印迹、Southern杂交等。

我研究生阶段的一部分工作是要将外源基因通过农杆菌介导的方法转入植物中，并鉴定转化是否成功。首先要用到质粒提取、DNA重组等技术来构建插入有外源基因的表达载体。转化植物成功后，就需要提取植物基因组DNA及总RNA，利用PCR扩增、Southern杂交、RT-PCR、蛋白质印迹等技术，对外源基因进行不同水平的鉴定。

正是因为分子生物学实验课对基本原理的详细讲解、对实验技能的系统训练，使我在工作中比较容易上手，工作进度也有了保证。另外，通过在这门课上系统地、全面的学习，也使我在工作需要学习新的实验技术时，触类旁通，比较容易理解消化。

分子生物学课程对我的科研工作的帮助

胡丽娅

进入实验室做课题已经一年多了，在日常的科研工作中，分子生物学实验课中学到的知识和技术给了我很大的帮助，例如“外源基因在大肠杆菌中的诱导表达”和“SDS－PAGE检测蛋白”等等。

我的课题主要是研究钙调磷酸酶的折叠机制，而整个研究的基础就是要拿到纯的、具有完整的生物活性的酶。这是整个工作的第一步，也是非常关键的一步。刚开始参与科研工作时，我遇到了蛋白表达为包含体的问题，因为拿不到蛋白，实验无法进行下去。于是我运用在分子生物学实验课中学到的知识，对表达条件进行了摸索，最终解决了表达的问题。顺利的进行了后续的实验工作。

随着课题的深入，我需要构建一个点突变体来观察这一位点对于钙调磷酸酶的结构和折叠的作用。由于有在分子生物学实验课中打下的基础，我利用Primer premier设计了点突变的引物，运用PCR技术对钙调磷酸酶进行点突变：质粒DNA的提取和酶切、E.coli感受态细胞的制备，转化。每一步实验都能够得到理想的结果。我想正是以前学到的知识和经验使我能够顺利的完成设计的实验。

通过一年多来的实验工作，我更加深切的体会到坚实的理论基础和良好的实验技能对于科研工作的重要性。在我本科的课程中，分子生物学实验课是一门尤其重要的课程，在这门课程的学习过程中，我和我的同学们都打下了很好的基础。整个课程的安排十分合理，给我们许多亲自动手实践的机会；在遇到问题时，老师鼓励我们积极思考，和我们一起讨论，帮助我们解决问题。每一个小实验的成功，对于我们这些“初生之犊”来说，都是一种莫大的鼓励，鼓励我们在科学研究中前进。

与此同时，我们在这门实验课的学习中还培养了良好的合作意识和团队精神。同学们齐心协力，一起动脑筋解决实验中的问题。在今天的科研工作中，这些品质让我们能够更好的融入到课题组这一个大家庭中，大家互相帮助，谁遇到了问题，大家一起讨论，出谋划策。同时，在讨论的过程中，大家也能学到更多的知识。

生命科学学院 2002硕 细胞生物学专业

王利敏

作为一名细胞所的二年级研究生，一年级所选修的分子生物学实验课程对我的帮助是不可忽视的。在这个课程上，让我初次接触到了许多进行生物研究时必须具备的实验技术以及一些基本技能，象电泳，蛋白质印迹，PCR等等，这些实验在几乎每个人以后的工作中都会用到，我也不例外。而且这些实验又不同于本科时，它不但是更复杂，还给了更多我们自己动手的空间和时间，一来能锻炼大家的思考能力，比如我们自己设计引物来合成目的基因；还能锻炼我们自己安排时间和一个实验进度的能力，分子实验一般周期比较长，学习如何合理地安排时间使之更有效的确对于今后自己实验地安排大有裨益。总之，分子生物学实验课程的确是一门对今后实验很有帮助地课程。

分子生物学实验课程学习随感

陈晖

时光荏苒，不知不觉中研究生生活已过去一年，进入实验室也有快一年的时间了。大学时专业课的学习为我的科研工作打下的坚实基础，而实验课程尤其是分子生物学实验的学习更让我获益匪浅。

分子生物学课程的学习让我们初步建立了分子的概念，但核酸到底是什么样子的，什么是PCR，什么是质粒，什么是转化，这些概念对于我们始终很抽象。是分子生物学试验让我们真正接触了分子生物学，将那些抽象的概念变得具体，而不再是纸上谈兵。

在分子生物学试验中我们学习到了分子生物学最基本的实验技能，如感受态细胞的制备及转化，质粒DNA的提取及酶切，植物总RNA的提取等等。这些技能的学习让我在科研工作中很快能进入角色。在开始进入实验室时，常会有种手足无措的感觉。但当看到那些熟悉的仪器，如微量移液器，培养箱，PCR仪等时，真有他乡遇故知的感觉。而不需别人指导，运用实验课上学到的知识成功地完成实验，那种满足感更是无法形容。至今还记得独立提出要用的质粒时的情形，师兄在夸奖之余将更多的工作放心地交给我，让我们实验的进展顺利很多。

不过最重要的是在分子生物学实验学习的过程中，我们建立了整体大实验的概念，这是在以往的实验训练中没有的。以往的实验如无机化学，有机化学等等，所涉及的通常只是某个数据的测定或某种物质的提取，实验持续的时间通常也就两三个小时;而分子生物学实验，每次会持续一天时间。实验设计得与科研比较相似，毫不夸张的讲，每个实验都可以直接用于科研。在这里我们学到了实验设计的概念，不是单纯的实验技术的堆砌，而是根据自己的目的，有机的将各种方法组合起来。所有这些都是我们进入科研工作所必须的素质。

而老师的讲解不会局限于某种技术，而是更偏重开拓思路，引导我们思考，从而达到举一反三的目的。如在讲解植物总RNA的提取时，采用的是白化的玉米叶子，所含糖类脂类比较少，此时老师会提出问题如果糖类多时又该如何改进提取的方法;书上所讲的只是其中一种提取方法，是否还有其他的方法可以提纯RNA。老师并不会直接给出这些问题的答案，而是要我们在课后自己查阅资料。这一方面锻炼了我们查阅文献的能力，另一方面这些资料的积累成为科研工作时宝贵的一手材料，可以直接应用于科研。“授人以鱼不如授人以渔”，老师们精心的讲解常会给我们豁然开朗的感觉，学习到的不是单纯的技术而是一种思路。

感谢分子生物学实验，感谢给予我们悉心教导的老师，是他们的工作使我们真正接触到了分子实验，并为将来进入科研工作打下了良好的基础。

分子生物学实验小结 2001级生物科学专业 张皓彬

做完半年的分子生物学实验，感到它是一门非常好的课，在我们学习生物学的过程中占据着很大的分量。

首先，分子生物学是一门技术性很强的实验，在实验的过程中，某些小的失误可能会对结果产生很大的影响。所以对实验中的操作是比较严格的，特别象无菌操作过程。在实验中从仪器上来说我们接触了大量的仪器，而且也学到了一些基本的实验技术，这对我们将来从事相关工作有着非常大的帮助。

其次，分子生物学实验中所含的知识和技术与理论知识结合的比较好，先学习了理论知识再去做实验，这样结合很好，而且我感觉分子生物学实验是我们所做的实验中一门设计到比较“高深”知识或新问题的实验，能激发出我们对学习分子生物学理论与实践的兴趣。

最后，我认为最重要的是它给了我们学生一次自己设计实验的机会。这是我们所做的实验中唯一能给我们自己设计实验机会的课。第一，整个过程中，我们在做完前面一些基本实验后，再去设计一个用自己所学到的知识技术的实验，有了一个整体的了解，也是对一整套技术的回顾与应用。从设计中所要用到的试剂、仪器，到实验中试剂的具体用量，仪器使用的具体参数，以及引物的设计和整个实验的时间安排等等都要有明确的概念，可以说是给了我一次科学探究的机会。第二，设计实验后我们自己去操作检验它的可行性，检验自己设计的实验能不能够成功，更重要的是整个过程对我们以后从事相关工作有着非常重要的帮助，所以这是非常有意义的。

总的来说，分子生物学实验是一门非常好的实验课程。

设计实验和具体操作的感想 生物科学2001级谷波

2003.12.22

设计阶段：

我们组原本的想法有点不切实际。我们打算在瑞士的一个酶库网站上找到一种酶，再从genenbank中找到这种酶的全序列，再自行设计引物。我们甚至下载了引物设计软件。然而我们输入某种酶某段功能片段的名称却从genebank中得到了成百上千序列，我们放弃了。只是从多篇文献中找到一种酶的某段基因把它的引物和表达载体进行改造和改换，以符合老师提供的限制性内切酶。而PCR的温度与循环次数，及其余的各种步骤，仅仅是把是实验书上的串联在一起，并没有考虑任何改动，更别提摸索实验条件的部分了。当我们的老师讲评时，我才了解到，我们的设计是多么的不充分，成功率有多低。

操作阶段：

通过实验设计，我最大的收获是有了串起已经做过的实验的思路，也明白了做重组的各个步骤的原理。所以，当我拿到老师给的设计方案时，我的思路很清晰。然而具体的操作又暴漏出许多问题。首先是操作时不能做到提前思考，大家往往只会照方抓药，不能事先想清楚为何要这样做。这使我们常常忽略细节的地方，造成时间的浪费甚至结果不理想。比如我们把第二次回收时的重要数据遗失。特别是写报告时，更会感觉到中间结果记录的不详细，以至分析原因时没有具体的可依赖的结果做支持。还有就是中间各个步骤的现象，如果我们能从最基本的实验时就观察现象，之后再做重复或类似的实验时，就能及时判断实验每一步的正确与否，便于及时纠正错误。最后是我们实验时心态不够正确，实验就是要历经失败和重复，不能面对不良结果时就急噪起来，不能心平气和的继续下去，甚至失去探索的动力。每当我们进度落后时，大家常常焦急的追赶其它组，往往造成不该出现的错误或遗漏。

实际操作不同于理论学习，它要求我们事事亲临，面面俱到，并且积累经验，这样才能从细微处窥探整个实验的成败。这正应了老师所说：“我们需要心灵，手巧，兼肯干的学生”心灵有赖于勤思考，手巧还需要多实践总结，肯干则要求我们持之以恒，脚踏实地我们会朝这个方向努力的。

生命科学学院2002硕 神经生物学专业

马骏

我是神经生物学专业研二的学生。我在研一时选修了分子生物学实验课，在一个学期的学习中所获甚多。分子生物学实验我们主要做的大实验包括感受态的制备、质粒的提取及鉴定、蛋白在大肠杆菌中的表达。我们在本科和研一的时候学习了分子生物学的理论知识，但通过大实验亲身实践后才更深刻的理解了这些理论知识，并且在遇到问题－解决问题的过程中，了解了这些知识用于实验时应注意的细节。通过系统科学的实验，我还了解了实验规划和实验安排的重性。分子生物学大实验锻炼了我的实验操作技能，培养了我耐心细致的实验习惯，这都有益于我现在所进行的课题研究，避免了走弯路，提高了实验效率。所以我认为在进行正式的课题研究之前进行分子生物学大实验的学习是很必要的。师弟师妹们请认真学习：）

实验心得

我是北京师范大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业2002级的硕士研究生，在研一第一学期参加了分子生物学实验课程。这门课程将分子生物学实验操作的理论与实践相结合，不仅使我在分子生物学实验技能方面得到系统的训练，而且让我对具体实验操作的原理有了清晰地认识。尤为难得的是，作为一门实验课，它还锻炼了我运用已学到的理论知识和已掌握的实验技能综合解决科学问题的能力。这些都为我之后研究生阶段的工作做了必要的准备，打下了良好的基础。

这门课程开设的实验以综合性为主，涵盖面广，几乎包括一般分子生物学研究会涉及的所有内容：最基本实验技术，如琼脂糖凝胶电泳检测DNA；基因克隆所要用到的技术，如质粒提取、DNA重组及重组子筛选、细菌感受态的制备及转化、外源基因的诱导表达等；还有一些其他的常用技术，如动、植物基因组DNA的提取、植物总RNA的提取、PCR扩增、蛋白质印迹、Southern杂交等。

我研究生阶段的一部分工作是要将外源基因通过农杆菌介导的方法转入植物中，并鉴定转化是否成功。首先要用到质粒提取、DNA重组等技术来构建插入有外源基因的表达载体。转化植物成功后，就需要提取植物基因组DNA及总RNA，利用PCR扩增、Southern杂交、RT-PCR、蛋白质印迹等技术，对外源基因进行不同水平的鉴定。

正是因为分子生物学实验课对基本原理的详细讲解、对实验技能的系统训练，使我在工作中比较容易上手，工作进度也有了保证。另外，通过在这门课上系统地、全面的学习，也使我在工作需要学习新的实验技术时，触类旁通，比较容易理解消化。

分子生物学实验课程如何应用于科研之我见

生命科学学院 生物化学与分子生物学专业 2003研 李彦杰

作为一名生物化学与分子生物学专业一年级的研究生，在生命科学领域5年的求知探索中，我深切体会到这期间学习的各门课程，包括生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、生理学，尤其是分子生物学实验课程，对培养我今后独立进行科研，及提高科研能力、拓宽科研思路是不可或缺的。由于它所包含的内容与科研连接最直接，最紧密，不仅教给我们实验的技术方法，还教给我们设计实验的思路及科研中必不可少的合作精神，可以说是生物科研最重要的基础课之一。

生物学方面的科研离不开我们在分子生物学实验课程中学到的技术和方法，而为了达到同一个实验目的可用的技术与方法常常不止一种，如何选择最合适的方法以取得最佳实验结果其实就是灵活应用分子生物学实验所学于科研的过程。以下是结合我的课题的一点粗浅体会。

我的科研课题是小鼠脑红蛋白及突变体的设计、融合表达、蛋白纯化及结构、性质测定，基本的流程是从小鼠脑组织中提取总RNA，设计带有合适酶切位点的引物，利用RT-PCR技术获得双链cDNA，再将双链cDNA双酶切的产物与同样经双酶切的GST融合表达载体pGEX-4T-3相连，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在2YT培养基中表达，过GST亲和层析柱初纯蛋白，凝血酶酶切获脑红蛋白和谷胱苷肽硫转酶，再经Sephadex-G75分子筛层析柱分离，得到电泳纯的脑红蛋白，冷干保存。

从第一步提取总RNA到转化感受态细胞，这些步骤全都是分子生物学实验课上学习过的基本实验方法，比如核酸电泳、蛋白电泳、PCR、构建载体、感受态制备、转化等，由于这些技术已经在分子生物学实验课上系统学习并亲身操作，因此在科研中使用这些技术时就能驾轻就熟。

但又不能完全照搬课本，有时需要根据实验过程中出现的具体问题对方法进行改良，添加适合的步骤或删减不需要的步骤。例如分子生物学实验中检验总RNA提取效果采用的是甲醛变性琼脂糖凝胶电泳法，甲醛的作用是使RNA酶变性，阻止其降解RNA，电泳结果能否出现18S和28S的条带能说明RNA 的主要成分rRNA是否完整，而我的课题中提总RNA的目的是需要其中的mRNA作为模板进行逆转录PCR，因此电泳检测只有相对意义，所以只用一般的电泳采用稍高的电压即可。设计RT-PCR引物过程中，严格按照分子生物学实验课程所学的PCR原理部分进行设计，设计出的引物满足引物长度15－30bp、G+C含量40％－50％、碱基随机分布和引物3'端与模板严格配对这几个基本要求。但实验结果表明用oligodT做第一轮引物能扩增成功，而用特异性引物则扩增失败，分析原因可能是RNA二级结构严重，因此需要消除RNA二级结构，使特异性引物能与模板紧密结合，采用扩增前将模板在65℃保温10分钟的方法成功解决了这一问题。

目前我的课题已经进行到蛋白纯化步骤，分子生物学实验课上所学帮助我顺利完成实验的上游即分子生物学阶段的初步工作。

分子生物学实验课的收获及其在实际科研中的应用 生命科学学院生物化学与分子生物学专业03级硕研 白 巍

“对一名生物化学与分子生物学专业的研究生来说，分子生物学实验技术是必须掌握的基本功。熟练的掌握基本的分子生物学实验技术是开展实际研究工作的前提。”这是我在一年实验工作中的最大体会。因此，更加体会到，分子生物学实验课对我的帮助有多大!

在这门课中，老师将分子生物学实验的一些基本方法和理论，包括：载体；分子生物学中常用的工具酶；电泳；PCR基因扩增；基因表达；印迹法及分子检测；克隆化定点诱变等等贯穿在感受态细胞的制备和转化；质粒的提取和酶切；哺乳动物基因组DNA的分离和提取；植物中总RNA的提取等十几个实验中讲授，让我们不但掌握了实验技术，更重要的是使我们弄懂这些实验的原理，为在自己的实际科研中运用这些方法设计实验更好的完成科研工作打下基础。

我自己在前一段时间的实验中就应用了许多分之生物学实验课中学到的知识.我在做真核细胞转染实验中需要用一种无关基因作对照,我们选择的是pKSgp120基因.为了转染真核细胞我们需将其克隆于真核载体PIRES1neo中.我们先将空载体PIRES1neo和带有pKSgp120基因的PUC19分别预转化在大肠杆菌DH5α的感受态细胞中,然后从中大量提取质粒.为免去设计定做引物在时间和费用上的浪费,我们设计了一个平端连接方法:将空载体PIRES1neo用EcoRV酶切,再用CIAP(碱性磷酸酶)去磷;将PUC19/ pKSgp120用EcoRI和HindⅢ双酶切,然后将两者用T4DNA连接酶连接酶连接后转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中在从中提取质粒进行酶切鉴定.可见,没有分子生物学实验课上对于实验基本方法理论的学习和对一些基础实验的操作训练,是很难完成上述实验工作的!

此外,在分子生物学实验课中,老师结合实际,由浅入深的给我们讲解了许多实验的原理和设计实验的方法思路,更是对我以后的实验工作有很大的指导作用,使我受益费浅!

中国协和医科大学基础医学院 2003级研究生 马艳妮

半年分子生物学实验课的学习，使我掌握了很多分子生物学的基本方法和技术，如核酸提取、纯化、鉴定的方法，克隆、表达载体的构建，PCR技术等，这些基本方法的学习及实验技能的训练，为我现阶段的实验工作奠定了基础。课程中所开设的很多实验，如蓝白斑筛选、Southern杂交等，均是很多高校本科教学中所不曾涉及的，为我们研究生阶段的学习提供了竞争优势。在课堂中所培养的良好实验习惯及对待实验科学、认真的态度也使我收益匪浅，并在今后的实验中继续坚持。在此感谢所有为这门课程认真工作的老师和同学们，谢谢你们！

第五篇：分子生物学实验讲义

实验 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

二、实验试剂

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10、6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）