第一篇：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范

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病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范

一、病理科免疫组织化学技术员培训规范：

凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学习、培训，经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。

二、病理科免疫组织化学染色操作规范 1.免疫组织化学染色前的准备事项(一)组织切片的制备

常规切片脱蜡至水（组织固定需用10%中性甲醛）(二)抗体的选择、稀释和保存

（1）选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等〕。

（2）对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度（3）抗体的原液应于分装后置于一20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价 降低)。（4）抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。（5）抗体的稀释。

(1)一般用0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。(2)或用0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。(三)被检测组织内抗原的修复

（1）经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。（2）抗原修复缓冲液。

(l)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M NaOH调节pH值至6.0)。(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码2/13

pH修复液等。

（3）抗原修复的常用方法。(l)胰蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化。

②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。

③37℃下温育20-40min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。

④蒸馏水冲洗，终止反应。

⑤阻断内源性过氧化物酶。

⑥进行免疫组织化学染色。（配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。）

（2)胃蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化.②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。

③37℃下温育10-30min(一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短).④浸人蒸馏水，终止反应。

⑤进行免疫组织化学染色。用1%胰蛋白酶液37℃下处理20min。(应以 0.1M HCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片 脱落。)（3)微波修复抗原法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液 200ml，盖上具有小孔的盖子。

③将该容器置于微波炉(705-800W)中央加热(95℃)5min，2次(于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥)。

④将该容器移出微波炉，置于室温下冷却15-20min。

⑤蒸馏水冲洗。

⑥阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑦用TBS或 PBS液冲洗。

⑧进行免疫组织化学染色。(4)热水浴法: 题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码3/13

①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②向装组织切片的容器加人足量(例如200ml)抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至95-99℃(不沸腾)预热。

③将组织切片插人已预热的容器内，温育20-40min。

④将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却20min。⑤室温下，用TBS、PBS或水洗。

⑥蒸馏水冲洗。

⑦阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑧用TBS或PBS液冲洗。

⑨进行免疫组织化学染色。

（5)压力锅法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②向4-5.5L的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的2/3)，不加阀情况 下加热至沸腾。

③将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。

④加阀情况下，将组织切片加压2min。

⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续20min。

⑥将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于TBS或PBS液中(以免组织切片干燥)。

⑦蒸馏水冲洗。

⑧阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑨用TBS或PBS液冲洗。

⑩进行免疫组织化学染色。

（四）组织切片中内源性酶的阻断

1.内源性过氧化物酶 主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法:最常用0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用15-30min，阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性(使特异性着色减弱)，而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。必须阻断内源性过氧化物酶时，可安排在第一抗体反应后进行，以减少抗原的破坏。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码4/13

2.内源性碱性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。阻断方法:应用1M左旋咪唑，作用15-30min。

3.内源性生物素 肝、胰、肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。阻断方法:先将切片浸于卵白素(0.5μg/ml)中15min，以缓冲液洗净后，移浸于生物素饱和溶液中15min，再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液;也可应用商供的阻断试剂盒(按说明书操作)。(五)正常血清保护

作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷，免疫组织化学染色时，易与带有正电荷的组织〔特别是纤维组织、变性和(或)坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等〕发生静电吸引而导致非特异性染色。去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加第一抗体前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：5-1：20;必要时可滴加2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保护作用时间10-20min。用于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。(六)缓冲液

用于稀释抗体，洗涤切片的缓冲液主要有两种。1.TBS(0.05M，pH7.6)，Tris一HCl缓冲液(0.SM，pH 7.6)100ml 8.5%NaCl 100ml 蒸馏水加至 1000ml Tris一HCI缓冲液(0.5M，pH7.6)三经甲基氨基甲烷(Tris)61g HCl 37ml 蒸馏水加至 1000ml 2．PBS(0.IM，pH 7.6)Na2 HPO4 · 12H2O2 29g NaH2PO4 · 2H2O 3g NaCl 85g 蒸馏水加至 1000ml 使用时用蒸馏水稀释10倍即成0.0lM。

二、免疫组织化学染色常用方法 题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码5/13

(一)直接法 1.脱蜡和水化。

2.3%过氧化氢或0.5%过氧化氢甲醇液，5min。

3.TBS或PBS缓冲液洗涤。4.抗原修复。

5.无关动物正常血清(适当稀释)20-30min。

6.甩去正常动物血清，滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，或增强的酶标多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗体于切片上，20-60min。7.TBS或PBS缓冲液洗涤。

8.0.04%-0.05%DAB(二氨基联苯胺四盐酸)H2O2液显色5-10min，镜下观察控制显色时间。底物配法:DAB 40-50mg；0.05M TBS(pH 7.6)l00ml；3% H2O2 100-200ml。9.缓冲液洗，流水洗涤。10.苏木精淡染细胞核。11.脱水，透明，封片。(二)间接法

l-5步同“直接法”。

6.滴加第一抗体于切片上，湿盒内温育30-60min。7.TBS或PBS缓冲液洗涤。

8.HRP标记抗体或用增强的酶标记多聚物(Enhanced Labeled一 Polymer Sys-tem，ELPS)抗体滴加切片上，湿盒内温育30min。9-14步同“直接法”的7-11步。(三)过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)法 1-5步同直接法。

6.适当稀释的第一抗体，湿盒内温育30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.第二抗体，湿盒内温育30min。9.缓冲液洗涤。

10.滴加PAP，湿盒内温育30min。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码6/13

11-15步同“直接法”的7-11步。

双PAP法:上述操作进行到第10步后，再重复7-10步1次，然后继续11-15步。(四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法 1-5步同“直接法”。

6.第一抗体，湿盒温育30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.酶联SPA，湿盒温育30min。9.缓冲液洗涤。

10-13步同“直接法”的8-11步。(五)ABC法和SABC法

ABC法是卵白素-生物素-酶复合物(Avidin--Biotin--Peroxidase Complex)法的简称。SABC法是链霉卵白素-生物素-酶复合物(Streptavidin一Biotin一peroxidase Complex)法的简称。l-5步同“直接法”。

6.第一抗体，湿盒温育30-60min.7.缓冲液洗涤。

8.生物素化的第二抗体，30min。9.缓冲液洗涤。

10.ABC复合物或SABC复合物(皆于使用前新鲜配制)，30-60min。11-15步同“直接法”7-11步。(六)LSAB(SP)法

LSAB(SP)法，是标记的链酶卵白素-生物素(Labeled Streptavidin--Biotin)法的简称，操作步骤同“ABC法”，只是以LSAB复合物替代ABC复合物。(七)CSA法

CSA法是催化信号放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的简称。1-5步同“直接法”。6.第一抗体，15-30min。7.缓冲液洗涤。

8.生物素标记的第二抗体，15-30min。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码7/13

9.缓冲液洗涤。

10.链霉卵白素-生物素-HRP复合物(用前新鲜配制)，15min。11.缓冲液洗涤。12.放大液，15min。13.缓冲液洗涤。

14.HRP-StrePtavidin，15min。15-19步同“直接法”的7-11步。(八)二步法Envision System Envision是通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体。1-5步同“直接法”。6.第一抗体，30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.Envision TM，10-30min。9-13步同“直接法”的7-11步。(九)双重免疫组织化学法.Sequential(1)鼠或兔抗体1，30-60min。

(2)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/HRP，30 min。(3)DAB(棕色)，2-10 min。(4)鼠或兔抗体2，30-60 min。

(5)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/AP，30 min。(6)AP(红色)。2.Simnl一Aaneous(1)混合鼠抗体1和兔抗体2，4℃，过夜或60 min。(2)Envision TM羊抗鼠/HRP和羊抗兔/AP。(3)AP染色。(4)HRP染色。

上述方法除注明温度者外，均可在室温(20-25℃)环境中进行;第一抗体温育后，如有必要可置于4℃题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码8/13

下过夜。

三、免疫组织化学染色的常用抗体标记物(一)上皮源性标记物 1.一般性标记物

（1）CK(角蛋白)CK亚型:①CK5/6;②CK7;③CK8;④CK10/13;⑤CK18;⑥CK19;⑦CK20。(2)EMA(上皮细胞膜抗原)。

2.特异性和(或)相对特异性上皮标记物

（1）CEA(癌胚抗原，标记胃癌、大肠癌).（2）CA242(肿瘤相关粘液抗原，标记胰腺癌、大肠癌)。

（3）TG(甲状腺球蛋白，标记甲状腺癌).（4）PSA(前列腺特异性抗原，标记前列腺癌)。

（5）PSAP(前列腺特异性酸性磷酸酶，标记前列腺癌).（6）34βE12(标记前列腺底细胞).（7）AFP(甲胎蛋白，标记肝癌、内胚窦癌).（8）Hepatoeyte(标记肝细胞癌)。

(9)β-HCG(β-绒毛膜促性腺激素，标记胎盘滋养层细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤).（10）CA125(卵巢癌).（二)间叶源性标记物

主要是Vimentin(vim，波形蛋白)等.（三）肌源性标记物 1.Desmin(Des，结蛋白)2.Actin(肌动蛋白）.3.SMA(平滑肌肌动蛋白).4.MSA(肌特异性肌动蛋白).5.Myosin(肌球蛋白).6.Myoglobin(MG，肌红蛋白)7.Myogen(肌浆蛋白).题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码9/13

8.MyoDI(肌调节蛋白).(四)血管源性标记物 FⅧRAg(第8因子相关抗原).CD31 CD34 UEA-l BNH9.(五)组织细胞源性标记物 1.CD68/KP-l.2.Lysozyme(溶菌酶)。3.a1-AT(a1-抗胰蛋白酶).4.a1-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)5.Mac387.淋巴造血组织源性标记物 1.全淋巴细胞

(1)CD45/LCA(白细胞共同抗原）。(2)TdT(末端脱氧核昔酸转移酶)。(3)CD30/Ki-1。2.全B细胞(1)Igκ。(2)Igλ。(3)CD20/L26。(4)CD79a。

(5)BLA36(B淋巴细胞抗原)。3.B细胞亚型(1)CDl0。

(2)CD21(标记滤泡性树突状细胞)。(3)CD23。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码10/13

(4)CD35(标记滤泡性树突状细胞)。(5)CD38.4.全T细胞(1)CD3。(2)CD5。(3)CD43。(4)CD45RO/UCHL-1.5.T细胞亚型(1)CDla。(2)CD4。(3)CD8。6.NK细胞(1)CD56。(2)CD57/Leu-7。(3)CD16/Leu-11。7.粒细胞和单核巨噬细胞(1)CD11c/LeuM5。(2)CD15/LeuM5。(3)Lysozyme(溶菌酶)。(4)al-AT(al-抗胰蛋白酶)。(5)al-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)。(6)CD68.(7)S-100蛋白.(8)Mac387。8.其他

(1)EMA(上皮细胞膜抗原).(2)CD99(尤因肉瘤标记物).(3)ALK-l(间变性淋巴瘤激酶)。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码11/13

(4)HLA-DR。(5)Bel-2。(6)Bel-6。(7)Bel-10。(8)Ki-67。

(9)CyclinD1(周期素D1)。(10)CD25。

(11)CD34。

（七）神经源性标记物 1.S-100蛋白.2.NSE（神经原特异性烯醇化酶）.3.Leu7。

4.Neurofilament(NF，神经微丝蛋白)。5.GFAP(胶质纤维酸性蛋白）

（八）神经内分泌源性标记物 1.激素标记物(1)CA(儿茶酚胺)。(2)5-HT(5-经色胺).(3)垂体激素。

①GH(促生长素)。

②PRL(催乳素)。

③ACTH(促肾上腺皮质激素).④TSH(促甲状腺素).⑤FSH(促滤泡素).⑥LH(促黄体素)。(4)甲状腺。

①TG(甲状腺球蛋白)。

②CT(降钙素)。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码12/13

(5)甲状旁腺:PTH(甲状旁腺素)。(6)胰岛。

①Insulin(胰岛素)。

②Glueagon(胰高糖素)。

③VIP(舒血管肠肽).④PP(胰多肽).⑤Someitostatin(生长抑素)。

⑥Gastrin(胃泌素)。2.非激素标记物

(1)NSE(神经原特异性烯醇化酶).(2)CgA(嗜铬素A).(3)SY(突触素).3.激素受体

（1）ER(雌激素受体）.（2）AR(雄激素受体）.（3）PR(孕激素受体).(九)细胞增殖标记物 1.PCNA(增殖细胞核抗原).2.Ki-67.（十）黑色素标记物 1.S-100蛋白.2.HMB45.3.Melanoma。

(十一）癌基因和（或）抑癌基因 1.bel-2.2.c-erbB-2.3.p53 4.p16(多肿瘤抑制基因)。题目：病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 市一—病理科—30 生效日期：2012年1月1日 版本号1.0 修改日期： 页码13/13

5.nm23。(十二)病原体标记物

1.Myoeobaeterium Bovis(分枝杆菌，抗卡介苗)。2.HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原).3.HBcAg(乙型肝炎病毒核心抗原).4.HPV(人乳头状瘤病毒)5.HTLV-1(人类T细胞白血病病毒)。

第二篇：病理科操作规范及流程

病理标本的验收规范及流程

病理科应有专人验收普通活体组织病理学检查(常规活检)申请单和送检的标本。

(二)病理科验收人员必须：

1． 同时接受同一患者的申请单和标本。

2． 认真核对每例申请单与送检标本及其标志（联号条或其他写明患者姓名、送检单位和送检日期等的标记）是否一致；对于送检的微小标本，必须认真核对送检容器内或滤纸上是否确有组织及其数量。发现疑问时，应立即向送检方提出并在申请单上注明情况。3．认真检查标本的标志是否牢附于放置标本的容器上。

4．认真查阅申请单的各项目是否填写清楚，包括：①患者基本情况［姓名、性别、年龄，送检单位（医院、科室）、床位、门诊号/住院号、送检日期、取材部位、标本数量等］，②患者临床情况［病史（症状和体征）、化验/影象学检查结果、手术（包括内镜检查）所见、既往病理学检查情况（包括原病理号和诊断）和临床诊断等］。5．在申请单上详细记录患者或患方有关人员的电话号码，以便必要时进行联络，并有助于随访患者。

(三)验收标本人员不得对申请单中由临床医师填写的各项内容进行改动。

不合格标本的处理规范与程序

1． 申请单与相关标本未同时送达病理科；

2．申请单中填写的内容与送检标本不符合； 3．标本上无有关患者姓名、科室等标志； 4．申请单内填写的字迹潦草不清； 5．申请单中漏填重要项目； 6．标本严重自溶、腐败、干涸等； 7．标本过小，不能或难以制做切片；

8．其他可能影响病理检查可行性和诊断准确性的情况。

病理科不能接收的申请单和标本一律当即退回申请医师，不予存放，并记录。病理标本检查和取材规范及程序

1.取材前阅读申请单中的内容，初步判断病变的性质。2.核对申请单的编号与标本的编号、标本的份数是否相符。３.对于核对无误的标本应按下列程序取材：

３.１小标本和不完整的标本通常为活检标本，应按如下标准取材。

３.１.1应描述和记录送检标本的数量（少量时精确计算，多量时进行估计）、大小（若干mm或cm；多量时聚拢测量）、形状、色泽和质地等。

３.１.2少量的小标本应全部取材制片。

３.１.３多量的小标本，原则上全部取材制片；数量过多时，可尽量多地取材制片，剩余的标本应置于4%的中兴甲醛中妥善保存备用。

３.１.４.黏膜和皮肤组织应“立埋”，即将黏膜面与包埋盒的 底面垂直。

３.１.5使用镊子夹取标本时须严防挤压组织。３.２大标本通常为手术标本，应按如下标准取材：

３.２.1 记录切除标本的手术类型。

３.２.2应描述和记录送检标本的大小（三维长度，mm或cm）、形状、色泽、表面、质地等，球形或接近球形的标本可测其直径（mm或cm）。必要时称重（g或kg）。

３.２.3检查切面：通常沿标本长径切开或剪开（囊性标本时），3 描述和记录其形状特点，例如囊性和实性及其所占比例、色泽、质地、纹理、坏死；囊肿壁的厚度及其内外表面、囊腔内容物及其性状等，有的脏器，例如前列腺、胰腺、甲状腺等，应间隔一定距离（甚至间距2mm左右）做多个平行切面，检查有无微小肿物。

３.２.4带有脏器的标本，应描述和记录病变处与有无脏器的毗邻关系特点。

３.２.5必要时，绘简图说明巨检病变的特点和解剖学关系，病注明取材部位的编号，以便镜检时定位。

３.２.6切取有代表性病变区域的组织制片，适量包括与病变区域毗邻的“正常”结构和坏死组织等。

３.２.7完整切除的肿瘤标本，切取的组织块应包括其包膜，较

大的肿瘤应酌情多处包膜取材。

３.２.8切取组织块的刀具必须锋利，严防挤压组织。３.２.9切取组织块的数量，依巨检病变的具体情况酌定，一般以满足诊断需要为准。组织块的面积，通常在2cmx1.5cm以内，厚度不宜超过3mm（快速包埋制片时则应尽量薄些）。

３.２.10组织块的切面应平整。需要指定组织块的包埋面时，可将其非包埋面切出凹痕作为标记。管壁和囊壁组织应立埋。

４.标本摄影，必要时酌情进行（标本固定前或固定后）。５.切取组织块的编号、数量和取材后是否尚有标本存留等均应在活检记录单的肉眼检查描写栏内和取材工作单中注明，以便镜检时核对切片。例如，1.组织较少，全部包埋制片者，可注明“全”字；2.针吸、内镜取材或少量易碎的组织，须用软纸妥善包裹（以防制片过程中丢失），可注明“包”字；3.取材后尚有存留的标本，可注明“留”字等。

６.需要重新肉眼检查标本时，应在有关病例活检记录单中补充必要的文字描述，需要补充切取组织块时，应按上述取材操作程序进行，并应在相关活检记录单、取材工作单中和编号小条上注明“补”字。常规石蜡包埋组织切片规范及程序

１.脱水（常温下）

3.2.1乙醇-甲醛（AF）液固定：60~120min。3.2.2 80%乙醇：60~120min。3.2.3 95%乙醇Ⅰ：60~120min。3.2.4 95%乙醇Ⅱ：60~120min。3.2.5 无水乙醇Ⅰ：30~60min。3.2.6无水乙醇Ⅱ：30~60min。3.2.7无水乙醇Ⅲ：30~60min。２.透明

a..二甲苯Ⅰ：20 min。b.二甲苯Ⅱ：20 min。c.二甲苯Ⅲ：20 min。

３.浸蜡

3.3 石蜡Ⅰ（45~50℃）：60 min。3.4 石蜡Ⅱ（56~58℃）：60 min。3.5 石蜡Ⅲ（56~58℃）：60 min。4 包埋

４.１先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经浸蜡的组织块，使组织的最大面或被特别指定的组织面埋入熔蜡中，应将组织块平整地置放于包埋模具底面的中央处。包埋于同一拉块的多块细小组织应彼此靠近并位于 同一平面上；腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。４.２将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。

４.３待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。

４.４从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡块），用刀片去除组织块周围的过多石蜡（组织周围保留1~2mm石蜡为宜）。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。

４.５将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧（编号应清晰可见）。４.６把修整好的蜡块烙贴在支持器上，准备切片。４.７使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。5 切片

5.1 切片刀或一次性切片刀必须锋利。5.2 载玻片必须洁净、光亮。

5.3 将切片刀或刀片安装在持刀座上（以150为宜）。

5.4 细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。

5.5 修块（粗切）。用右手匀速旋转切片机轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部切到。修块粗切片的厚度为15~2μm。

5.6 调节切片厚度调节器（一般为4~6μm），进行切片。5.7 以专用小镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀的蜡片放入 伸展器的温水中（45℃左右），使切片全面展开。

5.8 将蜡片附贴于载玻片上。蜡片应置放在载玻片右（或左）2/3处的中央，留出载玻片左（或右）1/3的位置用于贴附标签。蜡片与载玻片之间无气泡。

5.9 必须立即在置放了蜡片的载玻片一端，用优质记号笔或刻号笔准确、清楚地标记其相应的病理号。

5.10 将置放了蜡片的载玻片呈45℃斜置片刻；待载玻片上的水分流下后，将其置于烤箱中烘烤（60~62℃，30~60min），然后即可进行染色。

5.11 内镜小的活检，穿刺等组织需连续切片不少于６片。5.12 针对不同组织（如小活检，骨组织，淋巴结等），优化制片，染色流程，保证切片质量。术中快速冰冻切片的规范及程序

１.冰冻切片的制备

１.１打开照明开关，打开冰冻切片机的玻璃箱盖。１.2选择冻头，在冻头滴上冰冻切片机包埋剂适当。１.3 待组织完全冷冻后，将冻头移到切片刀口的冻口内，扭紧冻头，进行切片，切片时有节奏的来回推动摇手柄，切得完整且较薄的切片（厚度8-9um），即可贴在玻璃片上。

１.4 将切好的片子用95%的乙醇固定，然后进行染色、封片、镜检（同石蜡切片H-E染色步骤）。

１.5 工作完毕后将冻头上组织取出，放回送检的标本袋内，用10%的中性甲醛固定液固定。

１.6清扫切冰冻切片机箱，将冻头擦干后放回冰冻切片机内。

１.7关好冰冻切片机的玻璃箱盖，关闭照明电源。２.冰冻切片机须24h开机，长假或节假日前检查切片机箱内的结冻情况，必要时关机，化霜，清洁冰冻切片机。３.注意事项

３.1 制作冷冻切片所需的试剂和设备等应处于随时可供使用状态。

３.2 切取的组织块大小适宜（厚度<2mm），并尽快置于冷冻组织切片机上制备切片。

３.3 调节冷冻程度，试切合合适时便迅速切片。冷冻不足无法切片，冷冻过度切片易碎。

３.4 冷冻切片固定液

95%乙醇

50ml ４.单体标本的冰冻制片应在１５min内完成。术中快速冰冻诊断的规范及程序

１.临床医师在术前向患者或近亲属告知术中快速病理诊断的局限性，签署术中快速病理诊断知情同意书。

２.从标本接收到发出报告的时间，应在病理申请单上注明。３.有条件的由两位中／高级称职的病理医师共同签署快速活检的病理诊断意见。对于病变疑难、手术切除范围广泛和会严重致残的手术中快速活检，应由两位高级称职的病理医师共同签署会诊意见。主检病理医师签名的字迹应能辨认。

４.快速活检诊断意见一般在收到送检标本后３０min内发出；同一时间段内相继收到的多例患者标本或是同一例患者的多次标本，其发出报告的时间依次类推。对于疑难病变，可酌情延时报告。５.对于难以即时快速诊断的病变（例如病变不典型、交界性肿瘤病变或送检组织不足以明确诊断等），主检病理医师应向手术医师说明情况，恰如其分地签发病理诊断意见或告知需要等待常规石蜡切片进一步明确病理诊断。

６.主检病理医师签署的快速活检病理诊断意见，以书面形式报告（可传真或网络传输）。快速活检病理诊断意见报告书发出前应认真核对无误。

７.冷冻切片后剩余组织的处理

７.１ 冷冻切片后剩余的冷冻组织（简称 “冻后”）和冷冻切片取材后剩余、未曾冷冻的组织（简称“冻剩”），均应保存，用以制备常规石蜡切片，以便与冷冻切片进行对照观察。７.２“冻后”／“冻剩”组织的蜡块和切片需与同一病例手术后送检的切除标本编为同一病理号，并作出综合性诊断。

７.３当冷冻切片病理诊断意见与其“冻后”组织的常规石蜡-HE片的病理诊断不一致时，该例的病理诊断一般应以石蜡-HE片诊断为准。常用特殊染色的操作规范

胶原纤维染色

Van Gieson(VG)苦味酸-酸性品性红法

一、染色程序

1、组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。

2、切片脱蜡至水。

3、用Weigrt铁苏木精液染5-10min。

4、流水稍洗。

5、1%盐酸-乙醇迅速分化。

6、流水冲洗5-10min。

7、用Van Gieson液染1-2min。

8、倾去染液，直接用95%乙醇分化和脱水。

9、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

二、染色结果 胶原纤维呈鲜红色。细胞质、肌纤维和红细胞呈黄色，胞核呈蓝褐色。Maasson三色法

一、染色程序

1、组织块固定于4%中性甲醛液中。用Bouin液或Zenker固定时，流水冲洗组织块过夜，效果更好。常规脱水、石蜡包埋和切片。

2、切片脱蜡到水。组织块经Zenker液固定时应对切片进行除汞处理：（1）切片脱蜡后，以0.5%碘乙醇作用10min；（2）稍水洗；（3）以5%硫代硫酸钠作用5min；（4）流水冲洗10min。

3、gert铁苏木精液染5-10min。

4、流水冲洗。

5、1%盐酸-乙醇分化。

6、流水冲洗5-10min。

7、丽春红酸性品红液染5-10min。

8、蒸馏水稍洗。

9、1%磷钼酸水溶液处理约5min。

10、不用水洗，直接用苯胺蓝液复染5min。

11、0.2%冰醋酸处理1min。

12、95%乙醇脱水并洗去冰醋酸。

13、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

二、染色结果 胶原纤维呈蓝色。细胞质、肌纤维和红细胞呈红色，胞核呈蓝色。

网状纤维染色

氢氧化银氨液浸染法

一、染色程序

1、组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。

2、切片脱蜡至水。

3、酸化高锰酸钾液氧化5min。

4、稍水洗。

5、2%草酸水溶液漂白1-2min。

6、稍水洗。

7、2%硫酸铁铵水溶液媒染5min。

8、稍水洗，再用蒸馏水洗1次。

9、滴加Gordon-Sweet银氨液，作用1min。

10、蒸馏水稍洗。

11、4%中性甲醛液还原1min。

12、流水冲洗5-10min。

13、以0.2%氯化金调色1-2min。

14、蒸馏水洗。

15、固定于5%硫代硫酸钠2min。

16、用核固红液复染5-10min或行HE复染。

17、稍水洗。

18、常规脱水、透明，中性树胶封固。

二、染色结果 网状纤维呈黑色，胞核呈红色（用核固红复染）或（用苏木精复染），胶原纤维呈黄棕色，细胞质呈淡红色（用伊红复染）。

弹力纤维染色

醛品红法

一、染色程序

1、组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。

2、切片脱蜡至水。

3、用Lugol碘液处理5min。

4、稍水洗。5、5%硫代硫酸钠处理5min。

6、流水冲洗5min。7、70%乙醇稍洗。

8、醛品红液浸染10min。9、70%乙醇浸洗2次，每次约30s,至切片不再脱色为止。

10、稍水洗。

11、澄黄基液滴染约1s。

12、稍水洗。

14、常规脱水、透明，中性树胶封固。

二、染色结果 弹力纤维呈深紫色，底色为不同程度的黄色。

抗酸杆菌染色

苯酚碱性品红法

一、染色程序

1、组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。

2、切片用汽油松节油脱蜡2次，每次5-10min。

3、不经乙醇洗，只用纱布将切片周围余液擦干。

4、流水稍洗。

5、滴入苯酚碱性品红液，于室温下染15-30min。

6、流水洗去多余染液。

7、有20%硫酸水溶液分化至适当为止。（一般需1-5min）

8、用流水充分冲洗。

9、用Mayer苏木精浅染细胞核。

10、流水冲洗10-15min。

11、胸风扇把切片吹干。随即二甲苯透明，中性树胶封固。

二、染色结果 抗酸（包括麻风杆菌和结核杆菌）呈鲜红色，胞核呈蓝色。

淀粉样蛋白染色

甲醇刚果红法

一、染色程序

1、组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。

2、切片脱蜡至水。

3、甲醇刚果红液染10min，倾去余液。

4、用碱性乙醇急速分化约数秒，镜下控制。

5、水冲洗5min。

6、苏木精液浅染细胞核。

7、流水冲洗10min。

8、常规脱水、透明，中性树胶封固。

二、染色结果 淀粉样蛋白呈红色，细胞核呈蓝色。在偏光镜下，淀粉样蛋白呈现绿色双折光。

脂肪染色

苏丹Ⅲ染色法

一、染色程序

1、组织块固定于4%中性甲醛液中。

2、冷冻切，厚6-10um，如为新鲜组织，须用40%中性甲醛液固定10min，稍水洗后，用60%乙醇稍洗。

3、苏丹Ⅲ染液浸染1-2min。

4、70%乙醇稍洗去多余染液。

5、流水稍洗。

6、Mayer苏木精液复染胞核，必要进用1%盐酸-乙醇分化。

7、水洗10min，或于稀碳酸锂水溶液中促蓝。

8、阿拉伯糖胶或明胶封盖。

二、染色结果 中性脂肪呈猩红色、橙红色或橙黄至橙红色，细胞核呈蓝色。

糖原染色

高碘酸-无色品红（PAS）法。

一、染色程序

1、取新鲜薄片组织，立即用Gendre液固定6-12h或Cornoy液固定3-6h，其间可更换2次固定液，然后转入95%乙醇。

2、无水乙醇按常规脱水透明，石蜡包埋，切片厚4-5um。

3、取两张连续切片，分别作A和B记号，然后把B片脱蜡至水。

4、把B切片置入预热至37℃的1%淀粉液，于37℃温箱内消化1h，或用预热至37℃的唾液在37℃温箱消化30min。

5、取出切片稍水洗。

6、在消化过程中，把A片脱蜡至水。

7、在A、B两片同时滴入0.5%高碘酸水溶液氧化5-8min。

8、流水冲洗2min，再用蒸馏水洗1次。

9、于暗处，无色品红液加盖染色10-20min。

10、用0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次约1min。

11、流水冲洗2min。

12、1%甲基绿水溶液复染胞核3-5min，或用Mayer苏木精液浅染细胞核（必要时用盐酸乙醇分化，再用流水冲洗）。

13、稍水洗。

14、常规脱水、透明，中性树胶封固。

二、染色结果 A片上的细胞质呈现亮红色颗粒为阳性（显示糖原），经消化后B片应为阴性。

黏液染色

爱先蓝（pH 2.5）法

一、染色程序

1、组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。

2、切片脱蜡至水。

3、爱先蓝（pH 2.5）液染10-20min。

4、流水稍洗。

5、核固红复染5-10min，或用沙红染液复染2-3min。

6、稍水洗。

7、常规脱水、透明，中性树胶封固。

二、染色结果 唾液酸黏液和弱硫酸化黏液以及一般黏液均呈蓝色，各种强碱酸化黏液不着色或淡染，细胞核呈红色。免疫组化染色（Envision System）的规范及程序

1.切片脱蜡水洗：将石蜡切片浸于二甲苯5分钟，三次。取出切片置于100%无水乙醇中3分钟，两次；依次置入90%-70%各级酒精各3分钟。取出置于蒸馏水中。

2.抗原修复(根据一抗说明而定)。

3.取出置于蒸馏水中的切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加过氧化酶阻断剂（通常用3%的过氧化氢）于组织上避光孵育15分钟。蒸馏水冲洗，再将切片置入TBS缓冲液中，浸泡3分钟，三次。取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体（组织切勿干燥），平放于湿盒中。

4.滴加50-100毫升一抗工作液于组织上，室温孵育30分钟。用TBS液冲洗切片。将切片置入TBS缓冲液中，浸泡5分钟，三次。取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体（组织切勿干燥），平放于湿盒中。

5.滴加50-100毫升A液于组织上，室温孵育30分钟。用TBS液冲洗切片。将切片置入TBS缓冲液中，浸泡5分钟，三次。取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体（组织切勿干燥），平放于湿盒中。

6.滴加Y预备好的显色剂DAB工作液50-100微升，室温孵育5-10分钟，或光镜下控制显色。显色完毕后，用蒸馏水冲 洗终止显色。

7.苏木精复染。

8.各级酒精（70%-100%）脱水，每级3分钟。取出切片置入二甲苯5分钟，三次。

9.用封片胶封片。

病理诊断的规范及程序

1.诊断前注意事项

1．1病理医师进行诊断前，核对申请单和切片核查是否相符。1.2阅读申请单上所有填写的内容，对于不清楚的内容及时联系送检医师。

1.3阅片时必须全面，不要遗漏病变。

1.4疑难病例，应由上级医师复核，并签署全名。1.5因特殊原因迟发报告，应向临床医师说明迟发的原因。1.6有科内疑难病例会诊制度（2名以上高级职称人员参与），并有相应的记录和签字。

2.病理学诊断表述的基本类型

2.1 Ⅰ类：检材部位、疾病名称、病变性质明确和基本明确的病理学诊断。

2.2 Ⅱ类：不能完全肯定疾病名称、病变性质，或是对于拟诊的疾病名称、病变性质有所保留的病理学诊断意向，可在拟诊疾病/病变名称之前冠以诸如兵变“符合为”、“考虑为”、“倾向为”、“提示为”、“可能为”、“疑为”、“不能排除（除外）”之类的词语。

2.3 Ⅲ类：检材切片所显示的病变不足以诊断为某种疾病（即不能做出Ⅰ类或Ⅱ类病理学诊断），只能进行病变的形态描述。

2.4 Ⅳ类：送检标本应过于细小、破碎、固定不当、自溶、严重受挤压（变形）、被烧灼、干涸等，无法做出病理学诊断。

病理诊断报告书写的规范

1.病理学诊断报告书的基本内容

1.1患者的基本情况，包括病理号、姓名、性别、年龄、送检医师或科室（住院或门诊）、住院号和门诊号、送验和收检日期等。1.2巨检病变和镜下病变要点描述。1.3与病理学诊断相关技术的检验结果。1.4病理学诊断的描述。

1.5对于疑难病例或做出Ⅱ、Ⅲ类病理学诊断的病例，可酌情就病理学诊断及其相关问题附加：建议和注释及讨论等。1.6未经本病理科和（或）科外病理会诊的病例，可将各方病理会诊意见列于该例患者的病理学诊断报告书中。2.病理学诊断报告书的书写要求

2.1病理学诊断报告书的文字表述力求严谨、恰当、精练，条理和层次清楚。

2.2病理学诊断报告书应为一式二份，一份交予送检方，另一份随同患者的病理学检查申请单和病理学检查记录单一并存档。主检病理医师必须在每一份病理学诊断报告书上签名，不能以个人印章代替签名，不能由他人代为签名。主检病理医师签名的字迹应能辨认。

2.3手写的病理学诊断报告书必须二联复写，必须文字规范、字迹清楚，不得潦草、涂改。

2.4手写和计算机打印的病理学诊断报告书中的关键性文字，如“癌”、“瘤”、“ 阳性”、“阴性”和数字等，要认真核对，不得 有误。

2.5计算机打印的图文病理学诊断报告书提供的病变图象要准确，具有典型（代表）性，放大倍数适当。

2.6患者的基本情况项目必须严格按照送检临床医师填写的文字抄写或用计算机输录于病理学诊断报告书中，并认真核查无误，签发报告书的病理医师和病理科的其他人员都不得改动。2.7病理医师不得签发虚假的病理学诊断报告书，不得向临床医师和患方人员提供有病理医师签名的空白病理学诊断报告书。细胞学诊断的规范及程序

１.直接表述性诊断：适用于穿刺标本的细胞病理学诊断报告。根据形态学观察的实际情况，对于某种疾病／病变做出肯定性（Ⅰ类）、不同程度意向性（Ⅱ类）细胞学诊断，或是提供形态描述性（Ⅲ类）细胞学诊断，或是告知无法做出（Ⅳ类）细胞学诊断。[参考本章第一节的八(一)项：“病理学诊断表述的基本类型”] ２.间接分级性诊断：用于查找恶性肿瘤细胞的诊断。

Ⅰ级：未见恶性细胞 Ⅱ级：查见核异质细胞 Ⅱa：轻度核异质细胞 Ⅱb：重度核异质细胞 Ⅲ级：查见可疑恶性细胞 Ⅳ级：查见高度可疑恶性细胞 Ⅴ级：查见恶性细胞细胞病理学诊断报告书的基本内容

1.患者的基本情况项目，包括病理号、姓名、性别、年龄、送检医院／科室（住院／门诊）、住院号／门诊号、送检／收验日期等。2.细胞病理学诊断的表述（参见上项“细胞病理学诊断报告表述的基本类型”）。

3.必要时或条件允许时，可酌情就细胞病理学诊断及其相关问题附加：①某些建议（例如进行其他有关检查、再做活检、病理科外病理学会诊、密切随查/随访等）；②注释／讨论。

4.经过本病理科或/和科外病理会诊的病例，可将各方的细胞病理学诊断意见附于该例的细胞病理学诊断报告书中。病理学诊断报告书的发送

1.病理科自接收标本至签发该病理学诊断报告书的时间，一般为3-5个工作日，细胞病理诊断报告一般为2个工作日。

2.由于某些原因延迟取材、制片，或是进行其他相关技术检测，不能如期签发病理学诊断报告书时，应以口头或书面形式告知有关临床医师或患方，说明迟发病理学诊断报告书的原因。

3.病理科应有专人发送病理学诊断报告书，并有接受人的签字。4.病理科已经发出的病理学诊断报告书被遗失时，一般不予补发；必要时，经病理科主任同意可以抄件形式补发。

显微镜操作的标准化程序

1.目的

正确使用显微镜。

2.适用范围

全体病理科工作人员。3.具体操作

3.1将准备观察的切片放在载物台上。

3.2调光：开启显微镜的电源开关。

3.3对焦：先用粗调螺旋把低倍物镜下降至载物片上6cm处，然后上升物镜，直接看到物象，再用细螺旋把物镜调节到清晰处。

3.4观察：用低倍镜观察组织的一般结构，然后再用高倍镜进一步观察，必要时方使用油镜，再低倍镜转至高倍镜观察时，只要适当转动细调节即能看到物像。

3.5放置载物片时注意勿把盖玻片面向下，以免用高倍镜观察时因对不到焦点而压破玻片，甚至损坏镜头。

3.6观察显微镜物像时应养成同时睁开双眼的习惯，眼的观察位置也要适当，即应放在眼点处。

3.7用毕应将显微镜放回木箱或用罩盖好。

普洱市人民医院病理科操作规范及流程

目录

1.病理标本的验收规范及流程 „„„„„„„„1-2 2.不合格标本的处理规范与程序„„„„„„„„„3 3.病理标本检查和取材规范及程序„„„„„„„„.4-6 4.常规石蜡包埋组织切片规范及程序„„„„„„„...7-9 5.术中快速冰冻切片的规范及程序„„„„„„„„..10-11 6.术中快速冰冻诊断的规范及程序„„„„„„„„.12-13 7.特殊染色的操作规范„„„„„„„„„„„„14-21 8.免疫组化染色（Envision System）的规范及程序„22-23 9.病理诊断的规范及程序„„„„„„„„„„„„„24-25 10.病理诊断报告书写的规范„„„„„„„„„„.26-27 11.细胞学诊断的规范及程序„„„„„„„„„„„„28 12.细胞病理学诊断报告书的基本内容„„„„„„„„„„„29 13.病理学诊断报告书的发送„„„„„„„„„„„.30 14.显微镜操作的标准化程序„„„„„„„„31-32

第三篇：病理科免疫组化技术员培训

病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范

一、病理科免疫组织化学技术员培训规范：

凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学习、培训，经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。

二、病理科免疫组织化学染色操作规范 1.免疫组织化学染色前的准备事项(一)组织切片的制备

常规切片脱蜡至水（组织固定需用10%中性甲醛）(二)抗体的选择、稀释和保存

（1）选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等〕。

（2）对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度

（3）抗体的原液应于分装后置于一20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价 降低)。（4）抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。（5）抗体的稀释。

(1)一般用0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。(2)或用0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。(三)被检测组织内抗原的修复

（1）经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。（2）抗原修复缓冲液。

(l)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M NaOH调节pH值至6.0)。(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高pH修复液等。（3）抗原修复的常用方法。(l)胰蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化。

②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。

③37℃下温育20-40min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。

④蒸馏水冲洗，终止反应。

⑤阻断内源性过氧化物酶。

⑥进行免疫组织化学染色。（配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。）

（2)胃蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化.②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。

③37℃下温育10-30min(一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短).④浸人蒸馏水，终止反应。

⑤进行免疫组织化学染色。用1%胰蛋白酶液37℃下处理20min。(应以 0.1M HCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片 脱落。)（3)微波修复抗原法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液 200ml，盖上具有小孔的盖子。

③将该容器置于微波炉(705-800W)中央加热(95℃)5min，2次(于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥)。

④将该容器移出微波炉，置于室温下冷却15-20min。

⑤蒸馏水冲洗。

⑥阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑦用TBS或 PBS液冲洗。⑧进行免疫组织化学染色。(4)热水浴法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②向装组织切片的容器加人足量(例如200ml)抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至95-99℃(不沸腾)预热。

③将组织切片插人已预热的容器内，温育20-40min。

④将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却20min。⑤室温下，用TBS、PBS或水洗。

⑥蒸馏水冲洗。

⑦阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑧用TBS或PBS液冲洗。

⑨进行免疫组织化学染色。

（5)压力锅法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②向4-5.5L的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的2/3)，不加阀情况 下加热至沸腾。

③将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。

④加阀情况下，将组织切片加压2min。

⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续20min。

⑥将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于TBS或PBS液中(以免组织切片干燥)。

⑦蒸馏水冲洗。

⑧阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑨用TBS或PBS液冲洗。

⑩进行免疫组织化学染色。

（四）组织切片中内源性酶的阻断

1.内源性过氧化物酶 主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法:最常用0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用15-30min，阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性(使特异性着色减弱)，而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。必须阻断内源性过氧化物酶时，可安排在第一抗体反应后进行，以减少抗原的破坏。2.内源性碱性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。阻断方法:应用1M左旋咪唑，作用15-30min。

3.内源性生物素 肝、胰、肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。阻断方法:先将切片浸于卵白素(0.5μg/ml)中15min，以缓冲液洗净后，移浸于生物素饱和溶液中15min，再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液;也可应用商供的阻断试剂盒(按说明书操作)。(五)正常血清保护

作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷，免疫组织化学染色时，易与带有正电荷的组织〔特别是纤维组织、变性和(或)坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等〕发生静电吸引而导致非特异性染色。去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加第一抗体前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：5-1：20;必要时可滴加2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保护作用时间10-20min。用于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。(六)缓冲液

用于稀释抗体，洗涤切片的缓冲液主要有两种。1.TBS(0.05M，pH7.6)，Tris一HCl缓冲液(0.SM，pH 7.6)100ml 8.5%NaCl 100ml 蒸馏水加至 1000ml Tris一HCI缓冲液(0.5M，pH7.6)三经甲基氨基甲烷(Tris)61g HCl 37ml 蒸馏水加至 1000ml 2．PBS(0.IM，pH 7.6)Na2 HPO4 · 12H2O2 29g NaH2PO4 · 2H2O 3g NaCl 85g 蒸馏水加至 1000ml 使用时用蒸馏水稀释10倍即成0.0lM。

二、免疫组织化学染色常用方法(一)直接法 1.脱蜡和水化。

2.3%过氧化氢或0.5%过氧化氢甲醇液，5min。

3.TBS或PBS缓冲液洗涤。4.抗原修复。

5.无关动物正常血清(适当稀释)20-30min。

6.甩去正常动物血清，滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，或增强的酶标多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗体于切片上，20-60min。7.TBS或PBS缓冲液洗涤。

8.0.04%-0.05%DAB(二氨基联苯胺四盐酸)H2O2液显色5-10min，镜下观察控制显色时间。底物配法:DAB 40-50mg；0.05M TBS(pH 7.6)l00ml；3% H2O2 100-200ml。9.缓冲液洗，流水洗涤。10.苏木精淡染细胞核。11.脱水，透明，封片。(二)间接法

l-5步同“直接法”。

6.滴加第一抗体于切片上，湿盒内温育30-60min。7.TBS或PBS缓冲液洗涤。

8.HRP标记抗体或用增强的酶标记多聚物(Enhanced Labeled一 Polymer Sys-tem，ELPS)抗体滴加切片上，湿盒内温育30min。9-14步同“直接法”的7-11步。(三)过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)法 1-5步同直接法。

6.适当稀释的第一抗体，湿盒内温育30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.第二抗体，湿盒内温育30min。9.缓冲液洗涤。

10.滴加PAP，湿盒内温育30min。11-15步同“直接法”的7-11步。

双PAP法:上述操作进行到第10步后，再重复7-10步1次，然后继续11-15步。(四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法 1-5步同“直接法”。

6.第一抗体，湿盒温育30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.酶联SPA，湿盒温育30min。9.缓冲液洗涤。

10-13步同“直接法”的8-11步。(五)ABC法和SABC法

ABC法是卵白素-生物素-酶复合物(Avidin--Biotin--Peroxidase Complex)法的简称。SABC法是链霉卵白素-生物素-酶复合物(Streptavidin一Biotin一peroxidase Complex)法的简称。

l-5步同“直接法”。

6.第一抗体，湿盒温育30-60min.7.缓冲液洗涤。

8.生物素化的第二抗体，30min。9.缓冲液洗涤。

10.ABC复合物或SABC复合物(皆于使用前新鲜配制)，30-60min。11-15步同“直接法”7-11步。(六)LSAB(SP)法

LSAB(SP)法，是标记的链酶卵白素-生物素(Labeled Streptavidin--Biotin)法的简称，操作步骤同“ABC法”，只是以LSAB复合物替代ABC复合物。(七)CSA法

CSA法是催化信号放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的简称。1-5步同“直接法”。6.第一抗体，15-30min。7.缓冲液洗涤。

8.生物素标记的第二抗体，15-30min。9.缓冲液洗涤。

10.链霉卵白素-生物素-HRP复合物(用前新鲜配制)，15min。11.缓冲液洗涤。12.放大液，15min。13.缓冲液洗涤。

14.HRP-StrePtavidin，15min。15-19步同“直接法”的7-11步。(八)二步法Envision System Envision是通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体。1-5步同“直接法”。6.第一抗体，30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.Envision TM，10-30min。9-13步同“直接法”的7-11步。(九)双重免疫组织化学法.Sequential(1)鼠或兔抗体1，30-60min。

(2)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/HRP，30 min。(3)DAB(棕色)，2-10 min。(4)鼠或兔抗体2，30-60 min。

(5)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/AP，30 min。(6)AP(红色)。2.Simnl一Aaneous(1)混合鼠抗体1和兔抗体2，4℃，过夜或60 min。(2)Envision TM羊抗鼠/HRP和羊抗兔/AP。(3)AP染色。(4)HRP染色。

上述方法除注明温度者外，均可在室温(20-25℃)环境中进行;第一抗体温育后，如有必要可置于4℃ 下过夜。

三、免疫组织化学染色的常用抗体标记物(一)上皮源性标记物 1.一般性标记物

（1）CK(角蛋白)CK亚型:①CK5/6;②CK7;③CK8;④CK10/13;⑤CK18;⑥CK19;⑦CK20。(2)EMA(上皮细胞膜抗原)。

2.特异性和(或)相对特异性上皮标记物

（1）CEA(癌胚抗原，标记胃癌、大肠癌).（2）CA242(肿瘤相关粘液抗原，标记胰腺癌、大肠癌)。

（3）TG(甲状腺球蛋白，标记甲状腺癌).（4）PSA(前列腺特异性抗原，标记前列腺癌)。

（5）PSAP(前列腺特异性酸性磷酸酶，标记前列腺癌).（6）34βE12(标记前列腺底细胞).（7）AFP(甲胎蛋白，标记肝癌、内胚窦癌).（8）Hepatoeyte(标记肝细胞癌)。

(9)β-HCG(β-绒毛膜促性腺激素，标记胎盘滋养层细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤).（10）CA125(卵巢癌).（二)间叶源性标记物

主要是Vimentin(vim，波形蛋白)等.（三）肌源性标记物 1.Desmin(Des，结蛋白)2.Actin(肌动蛋白）.3.SMA(平滑肌肌动蛋白).4.MSA(肌特异性肌动蛋白).5.Myosin(肌球蛋白).6.Myoglobin(MG，肌红蛋白)7.Myogen(肌浆蛋白).8.MyoDI(肌调节蛋白).(四)血管源性标记物 FⅧRAg(第8因子相关抗原).CD31 CD34 UEA-l BNH9.(五)组织细胞源性标记物 1.CD68/KP-l.2.Lysozyme(溶菌酶)。3.a1-AT(a1-抗胰蛋白酶).4.a1-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)5.Mac387.淋巴造血组织源性标记物 1.全淋巴细胞

(1)CD45/LCA(白细胞共同抗原）。(2)TdT(末端脱氧核昔酸转移酶)。(3)CD30/Ki-1。2.全B细胞(1)Igκ。(2)Igλ。(3)CD20/L26。(4)CD79a。

(5)BLA36(B淋巴细胞抗原)。3.B细胞亚型(1)CDl0。

(2)CD21(标记滤泡性树突状细胞)。(3)CD23。

(4)CD35(标记滤泡性树突状细胞)。(5)CD38.4.全T细胞(1)CD3。(2)CD5。(3)CD43。(4)CD45RO/UCHL-1.5.T细胞亚型(1)CDla。(2)CD4。(3)CD8。6.NK细胞(1)CD56。(2)CD57/Leu-7。(3)CD16/Leu-11。7.粒细胞和单核巨噬细胞(1)CD11c/LeuM5。(2)CD15/LeuM5。(3)Lysozyme(溶菌酶)。(4)al-AT(al-抗胰蛋白酶)。(5)al-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)。(6)CD68.(7)S-100蛋白.(8)Mac387。8.其他

(1)EMA(上皮细胞膜抗原).(2)CD99(尤因肉瘤标记物).(3)ALK-l(间变性淋巴瘤激酶)。(4)HLA-DR。(5)Bel-2。(6)Bel-6。(7)Bel-10。(8)Ki-67。

(9)CyclinD1(周期素D1)。(10)CD25。

(11)CD34。

（七）神经源性标记物 1.S-100蛋白.2.NSE（神经原特异性烯醇化酶）.3.Leu7。

4.Neurofilament(NF，神经微丝蛋白)。5.GFAP(胶质纤维酸性蛋白）

（八）神经内分泌源性标记物 1.激素标记物(1)CA(儿茶酚胺)。(2)5-HT(5-经色胺).(3)垂体激素。

①GH(促生长素)。

②PRL(催乳素)。

③ACTH(促肾上腺皮质激素).④TSH(促甲状腺素).⑤FSH(促滤泡素).⑥LH(促黄体素)。(4)甲状腺。

①TG(甲状腺球蛋白)。

②CT(降钙素)。

(5)甲状旁腺:PTH(甲状旁腺素)。(6)胰岛。

①Insulin(胰岛素)。

②Glueagon(胰高糖素)。

③VIP(舒血管肠肽).④PP(胰多肽).⑤Someitostatin(生长抑素)。

⑥Gastrin(胃泌素)。2.非激素标记物

(1)NSE(神经原特异性烯醇化酶).(2)CgA(嗜铬素A).(3)SY(突触素).3.激素受体（1）ER(雌激素受体）.（2）AR(雄激素受体）.（3）PR(孕激素受体).(九)细胞增殖标记物 1.PCNA(增殖细胞核抗原).2.Ki-67.（十）黑色素标记物 1.S-100蛋白.2.HMB45.3.Melanoma。

(十一）癌基因和（或）抑癌基因 1.bel-2.2.c-erbB-2.3.p53 4.p16(多肿瘤抑制基因)。5.nm23。(十二)病原体标记物

1.Myoeobaeterium Bovis(分枝杆菌，抗卡介苗)。2.HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原).3.HBcAg(乙型肝炎病毒核心抗原).4.HPV(人乳头状瘤病毒)5.HTLV-1(人类T细胞白血病病毒)。

第四篇：病理科制度职责及操作规范

病理科主任（副主任）医师岗位职责

一：资格要求

1：具有主任（副主任）医师专业技术职务任职资格。2：具有执业医师资格并注册。二：知识要求

1：精通本专业基础理论和专业知识掌握本专业国内外发展趋势，能够解决疑难特殊病例。能吸收最新科研成果并应用于实践工作。

2：借助工具书能阅读本专业的外文资料。

3：熟练掌握计算机操作，取得计算机中级上岗证书（3—5年取得）。

4：通过继续教育不断提高，更新专业知识水平。三：能力要求

1：理解判断能力：对诊疗过程中出现的各种问题做出正确的分析判断，并妥善进行处理。

2：组织实施能力：能够组织和开展本专业的工作，培养下级医师，实施和指导本专业的科研工作。

3：业务实施能力：参加并负责签发疑难、特殊病理报告及术中快速冰冻报告。

4：教学能力：具有承担专题讲座或讲课的能力。

5：语言文字能力：具有较强的书面文字能力及口头表达能力。

病理科主治医师岗位职责

一：资格要求

1：具有主治医师专业技术职务任职资格。2：具有执业医师资格并注册。二：知识要求

1：熟悉本专业基础理论和专业知识，掌握本专业国内外发展趋势，能吸收最新科研成果并应用于实践工作。2：借助工具书能阅读本专业的外文资料。

3：熟练掌握计算机操作，取得计算机中级上岗证书（3—5年取得）。

4：通过继续教育不断提高，更新专业知识水平。三：能力要求

1：理解判断能力：对诊疗过程中出现的各种问题做出正确的分析判断，并进行处理。

2：组织实施能力：能够实施开展本专业的业务工作，代教下级医师，协助参与本专业的科研工作。

3：业务实施能力：能够独立签发常见